Este protocolo describe cómo se puede utilizar la técnica de pinza de parche para estudiar la capacidad termogénica de las mitocondrias midiendo directamente la fuga de protones mitocondriales a través de la membrana mitocondrial interna. La medición directa de la corriente de protones a través de la membrana mitocondrial interna ayuda a identificar y caracterizar con precisión los mecanismos moleculares responsables de la termogénesis mitocondrial. Esta técnica permite no solo medir la corriente de protones a través de la membrana mitocondrial interna, sino también estudiar otras conductancias importantes para la función mitocondrial, como el calcio o metabolitos como los nucleótidos de adenina.
Coloque el ratón sacrificado sobre su espalda y rocíe alcohol para limpiar y mojar el cabello. Luego, haga una incisión de dos centímetros en el tórax. Después de agarrar la piel con pinzas, diseccionar el corazón del pecho del animal y enjuagarlo para eliminar toda la sangre en un vaso de precipitados de 10 mililitros con cinco mililitros de solución de aislamiento en frío.
Una vez que el corazón haya sido limpiado de rastros de sangre, transfiéralo a otro vaso de precipitados de 10 mililitros que contenga cinco mililitros de tampón de aislamiento frío y córtelo en trozos delgados. Luego, transfiéralo a un homogeneizador de vidrio de 10 mililitros refrigerado por hielo. Use un agitador superior para homogeneizar el tejido precortado en hielo con seis golpes suaves a una velocidad controlada de 275 rotaciones por minuto.
Transfiera el homogeneizado a un tubo cónico helado de 15 mililitros y centrífuguelo a 700 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para granular los núcleos y las células intactas. Recoge el sobrenadante en un tubo fresco de 15 mililitros y colócalo sobre hielo. Centrifugar el sobrenadante a 8, 500 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Centígrados para obtener un gránulo que contenga las mitocondrias.
Resuspend el pellet mitocondrial en 3,8 mililitros de tampón de manitol hipertónico helado e incubar la suspensión mitocondrial en hielo durante 10 a 15 minutos. Llene la suspensión de manitol hipertónico mitocondrial en una celda de minipresión refrigerada de la prensa francesa. Luego, coloque la celda en la prensa francesa.
Luego, seleccione el modo bajo de la prensa francesa y comprima la suspensión a través de la celda de minipresión a 110 en el dial para las mitocondrias de grasa marrón, y a 140 para las mitocondrias del corazón, asegurando que la suspensión salga de la celda de minipresión a una velocidad de aproximadamente una gota por segundo. Recoge las gotas en un tubo cónico helado de 15 mililitros. Centrifugar la suspensión a 10, 500 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Resuspender el pellet de mitoplastos en 0.5 a 2 mililitros de tampón de cloruro de potasio hipertónico helado y almacenar la suspensión en hielo. Tire de los filamentos de vidrio de borosilicato el día de la grabación utilizando un extractor de micropipetas, estableciendo un programa en el extractor utilizado para generar pipetas con un alto grado de reproducibilidad. Inserte un filamento de vidrio dentro del extractor y tire para obtener casi dos pipetas de parche idénticas de un filamento de borosilicato.
Ajuste el programa cuando las pipetas se vuelvan inconsistentes entre los ciclos de tracción debido al envejecimiento del filamento de la caja de calentamiento del extractor. Coloque la pipeta dentro del pulidor de pipetas y coloque la punta cerca del filamento con un aumento de 100X para pulirla al fuego. Presione el pedal varias veces para calentar el filamento sin obstruir o dañar la curva de la punta.
Se pulen hasta que las pipetas tengan una resistencia entre 25 y 35 megaohmios cuando se llenan con solución de pipeta a base de TMA. La cubierta preincubada se desliza con gelatina al 0,1% para reducir la adhesión del mitplasto y enjuagarlas con la solución de baño de cloruro de potasio antes de depositar la suspensión de mitplastos. Prepare una dilución cruda mezclando aproximadamente 35 microlitros de la suspensión de mitoplastos concentrados con 500 microlitros de la solución de baño de cloruro de potasio y colóquela en las hojas de cubierta previamente colocadas en un pozo de una placa de cuatro pocillos.
Incubar en hielo durante 15 a 20 minutos para que los mitoplastos sedimenten por el resbalón de la cubierta. Llene la cámara de baño completamente con aproximadamente 50 microlitros de la solución de baño de cloruro de potasio y transfiera un resbalón de cubierta con mitóticos dentro de la cámara utilizando pinzas de microdisección delgadas con una punta doblada. Coloque el resbalón de la cubierta en la parte inferior de la cámara sin perfundir la cámara para mantener los mitóticos estables en el resbalón de la cubierta.
Elija un mitplasto no adhesivo individual escaneando el deslizamiento de la cubierta bajo el microscopio con un objetivo 60X. Cargue la pipeta con la solución de pipeta y colóquela en el soporte de pipeta. Lleve la pipeta a la solución de baño con un micromanipulador y muévala justo encima del mitoplastia seleccionado para acercarse a la IMM.
Mantenga el potencial de membrana a cero milivoltios y aplique pulsos de 10 milivoltios utilizando el comando de prueba de membrana en el programa del amplificador. Aplique una ligera presión negativa para crear rápidamente un gigaseal con el IMM. Levante la pipeta con el mitplasto unido para mantenerlos alejados del deslizamiento de la cubierta para evitar la rotura del sello debido a la deriva de la pipeta durante el experimento.
Compense los transitorios de capacitancia perdida con el comando de prueba de membrana en el programa del amplificador antes de probar la configuración de mitoplasto completo para obtener una medición de capacitancia correcta para la membrana del mitoplasto después del robo. Aplique pulsos de voltaje de corta duración con el programa amplificador para romper el parche de membrana debajo de la pipeta de vidrio y lograr la configuración de mitoplasto completo. Después del robo, ajuste los transitorios de capacitancia con la opción de prueba de membrana del programa del amplificador para evaluar la capacitancia de la membrana y su resistencia de acceso.
Inmediatamente después del robo, reemplace la solución de baño de cloruro de potasio con una solución de baño HEPES a través de perfusión. Aplique un protocolo de rampa de 850 milisegundos con el programa amplificador. La aplicación del protocolo de rampa de voltaje induce una corriente de protones de gran amplitud a través del IMM de grasa marrón sin la adición de ácidos grasos exógenos, los activadores requeridos de los UCP.
Después de la perfusión por guanosina difosfato inhibidor de UCP1 o ciclodextrina de metil beta 10 milimolar para la extracción de ácidos grasos de membrana endógena, la corriente residual se utiliza para determinar la amplitud de las corrientes de UCP1, que desaparece por completo en la IMM de ratones deficientes en UCP1. A diferencia de la grasa marrón, la IMM de los tejidos no adiposos, como el músculo esquelético y el corazón, no desarrolla una corriente de protones medible inmediatamente después del robo. Para inducir una corriente de protones medible a través de CAA, es esencial aplicar la solución de baño HEPES que contiene de uno a dos micromolares de ácidos grasos exógenos.
Para confirmar que la corriente de protones medida es transportada por AAC, es importante aplicar inhibidores específicos, carboxiatractyloside, que inhiben casi por completo la corriente de protones mostrada en el IMM de ratones deficientes en AAC1. Una inhibición constante pero nunca completa de la fuga de protones se logra solo cuando ADP está presente en ambos lados de la membrana para generar un intercambio activo de nucleótidos a través de AAC. La calidad de la preparación del mitplasto influirá en la tasa de éxito en el logro de la configuración de mitoplasto completo.
Es fundamental optimizarlo. Una vez que el mecanismo molecular de la termogénesis mitocondrial se disecciona con la técnica de pinza de parche, la medición del consumo de oxígeno mitocondrial demostrará la importancia de la corriente de protones y la termogénesis en las mitocondrias intactas. Esta técnica abre el camino para que los investigadores exploren todo tipo de conductancias, iones y metabolitos importantes para el funcionamiento de las mitocondrias.
