Dieses Protokoll beschreibt, wie die Patch-Clamp-Technik verwendet werden kann, um die thermogene Kapazität von Mitochondrien zu untersuchen, indem das mitochondriale Protonenleck über die innere mitochondriale Membran direkt gemessen wird. Die direkte Messung des Protonenstroms durch die innere mitochondriale Membran hilft, die molekularen Mechanismen, die für die mitochondriale Thermogenese verantwortlich sind, zu identifizieren und genau zu charakterisieren. Diese Technik ermöglicht es nicht nur, den Protonenstrom über die innere mitochondriale Membran zu messen, sondern auch andere Leitwerte zu untersuchen, die für die mitochondriale Funktion wichtig sind, wie Kalzium oder Metaboliten wie Adeninnukleotide.
Positionieren Sie die eingeschläferte Maus auf dem Rücken und sprühen Sie Alkohol ein, um das Haar zu reinigen und zu benetzen. Machen Sie dann einen zwei Zentimeter großen Schnitt am Thorax. Nachdem Sie die Haut mit einer Pinzette erfasst haben, sezieren Sie das Herz von der Brust des Tieres und spülen Sie es aus, um das gesamte Blut in ein 10-Milliliter-Becherglas mit fünf Millilitern kalter Isolationslösung zu entfernen.
Sobald das Herz von Blutspuren befreit ist, geben Sie es in ein anderes 10-Milliliter-Becherglas, das fünf Milliliter kalten Isolationspuffer enthält, und zerkleinern Sie es in dünne Stücke. Dann geben Sie es in einen eisgekühlten 10-Milliliter-Glashomogenisator. Verwenden Sie einen Überkopfrührer, um das vorgeschnittene Gewebe auf Eis mit sechs sanften Strichen bei einer kontrollierten Geschwindigkeit von 275 Umdrehungen pro Minute zu homogenisieren.
Übertragen Sie das Homogenat auf ein 15-Milliliter-eiskaltes konisches Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 700 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Kerne und ungebrochenen Zellen zu pelletieren. Sammeln Sie den Überstand in einem frischen 15-Milliliter-Schlauch und legen Sie ihn auf Eis. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 8.500 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um ein Pellet zu erhalten, das die Mitochondrien enthält.
Schwebe das mitochondriale Pellet in 3,8 Milliliter eiskaltem hypertonem Mannitolpuffer und inkubiere die mitochondriale Suspension auf Eis für 10 bis 15 Minuten. Füllen Sie die mitochondriale hypertone Mannitolsuspension in eine gekühlte Mini-Druckzelle der französischen Presse. Legen Sie dann die Zelle auf die französische Presse.
Wählen Sie dann den niedrigen Modus der französischen Presse und komprimieren Sie die Suspension durch die Mini-Druckzelle bei 110 auf dem Zifferblatt für die braunen Fettmitochondrien und bei 140 für die Herzmitochondrien, um sicherzustellen, dass die Suspension mit einer Rate von etwa einem Tropfen pro Sekunde aus der Mini-Druckzelle kommt. Sammeln Sie die Tropfen in einem 15-Milliliter-eisgekühlten konischen Rohr. Zentrifen Sie die Suspension bei 10.500 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Resuspendiert das Mitoplastenpellet in 0,5 bis 2 Milliliter eiskaltem hypertonem Kaliumchloridpuffer und lagert die Suspension auf Eis. Ziehen Sie die Borosilikatglasfilamente am Tag der Aufnahme mit einem Mikropipettenabzieher und stellen Sie ein Programm auf dem Abzieher ein, der zum Erzeugen von Pipetten mit hoher Reproduzierbarkeit verwendet wird. Führen Sie ein Glasfilament in den Abzieher ein und ziehen Sie, um fast zwei identische Patchpipetten aus einem Borosilikatfilament zu erhalten.
Passen Sie das Programm an, wenn Pipetten aufgrund der Alterung des Heizkastenfilaments des Abziehers zwischen den Zugzyklen inkonsistent werden. Positionieren Sie die Pipette im Inneren des Pipettenpolierers und platzieren Sie die Spitze in der Nähe des Filaments unter 100-facher Vergrößerung, um sie zu polieren. Drücken Sie mehrmals auf das Fußpedal, um das Filament zu erwärmen, ohne die Spitzenkurve zu verstopfen oder zu beschädigen.
Polieren, bis die Pipetten einen Widerstand zwischen 25 und 35 Megaohm haben, werden erhalten, wenn sie mit TMA-basierter Pipettenlösung gefüllt werden. Vorinkubierende Deckscheine mit 0,1% Gelatine, um die Mitoplast-Adhäsion zu reduzieren und sie mit der Kaliumchlorid-Badelösung abzuspülen, bevor die Mitoplast-Suspension abgeschieden wird. Bereiten Sie eine Rohverdünnung vor, indem Sie etwa 35 Mikroliter der konzentrierten Mitoplastsuspension mit 500 Mikrolitern der Kaliumchlorid-Badelösung mischen und auf die zuvor in einer Vertiefung einer Vier-Well-Platte platzierten Deckscheine legen.
15 bis 20 Minuten auf Eis inkubieren, damit Mitoplasten den Deckslip absacken können. Füllen Sie die Badekammer vollständig mit ca. 50 Mikrolitern der Kaliumchlorid-Badelösung und übertragen Sie einen Deckzettel mit Mitoplasten innerhalb der Kammer mit einer dünnen Mikrodissektionspinzette mit einer gebogenen Spitze. Ordnen Sie den Deckzettel am Boden der Kammer an, ohne die Kammer zu durchbluten, um die Mitoplasten auf dem Deckglas stabil zu halten.
Wählen Sie einen individuellen, nicht klebenden Mitoplasten, indem Sie den Deckschlitten unter dem Mikroskop mit einem 60X-Objektiv scannen. Beladen Sie die Pipette mit der Pipettenlösung und legen Sie sie in den Pipettenhalter. Bringen Sie die Pipette mit einem Mikromanipulator in die Badlösung und bewegen Sie sie knapp über den ausgewählten Mitoplasten, um sich dem IMM zu nähern.
Halten Sie das Membranpotential bei null Millivolt und wenden Sie 10 Millivoltimpulse mit dem Membrantestbefehl im Verstärkerprogramm an. Üben Sie einen leichten Unterdruck aus, um schnell eine Gigaseal mit dem IMM zu erstellen. Heben Sie die Pipette mit dem Mitoplast an, um sie vom Deckschlupf fernzuhalten, um den Dichtungsbruch aufgrund von Pipettendrift während des Experiments zu vermeiden.
Kompensieren Sie die Streukapazitätstransienten mit dem Membrantestbefehl im Verstärkerprogramm, bevor Sie die Gesamt-Mitoplast-Konfiguration testen, um nach dem Einbruch eine korrekte Kapazitätsmessung für die Mitoplastmembran zu erhalten. Wenden Sie kurzzeitige Spannungsimpulse mit dem Verstärkerprogramm an, um das Membranpflaster unter der Glaspipette zu brechen und die Gesamt-Mitoplast-Konfiguration zu erreichen. Passen Sie nach dem Einbruch die Kapazitätstransienten mit der Membrantestoption des Verstärkerprogramms an, um die Membrankapazität und ihren Zugangswiderstand zu beurteilen.
Ersetzen Sie unmittelbar nach dem Einbruch die Kaliumchlorid-Badelösung durch eine HEPES-Badelösung durch Perfusion. Wenden Sie ein 850-Millisekunden-Rampenprotokoll mit dem Verstärkerprogramm an. Die Anwendung des Spannungsrampenprotokolls induziert einen Protonenstrom mit großer Amplitude über das IMM von braunem Fett ohne die Zugabe von exogenen Fettsäuren, den erforderlichen Aktivatoren von UCPs.
Nach Perfusion entweder durch UCP1-Inhibitor Guanosindiphosphat oder 10-millimolares Methylbeta-Cyclodextrin zur endogenen Membranfettsäureextraktion wird der Reststrom verwendet, um die Amplitude der UCP1-Ströme zu bestimmen, die im IMM von UCP1-defizienten Mäusen vollständig verschwindet. Im Gegensatz zu braunem Fett entwickelt das IMM von Nicht-Fettgeweben wie Skelettmuskulatur und Herz unmittelbar nach dem Einbruch keinen messbaren Protonenstrom. Um einen messbaren Protonenstrom durch AAC zu induzieren, ist es wichtig, die HEPES-Badelösung anzuwenden, die ein bis zwei Mikromolar exogene Fettsäuren enthält.
Um zu bestätigen, dass der gemessene Protonenstrom von AAC getragen wird, ist es wichtig, spezifische Inhibitoren, Carboxyatractylosid, anzuwenden, die den Protonenstrom, der im IMM von AAC1-defizienten Mäusen gezeigt wird, fast vollständig hemmen. Eine konstante, aber nie vollständige Hemmung des Protonenlecks wird nur erreicht, wenn ADP auf beiden Seiten der Membran vorhanden ist, um einen aktiven Nukleotidaustausch über AAC zu erzeugen. Die Qualität der Mitoplast-Zubereitung beeinflusst die Erfolgsquote bei der Erreichung der Whole-Mitoplast-Konfiguration.
Es ist wichtig, es zu optimieren. Sobald der molekulare Mechanismus der mitochondrialen Thermogenese mit der Patch-Clamp-Technik seziert wurde, wird die Messung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs die Bedeutung von Protonenstrom und Thermogenese in intakten Mitochondrien demonstrieren. Diese Technik öffnet den Forschern den Weg, alle Arten von Leitwerten, Ionen und Metaboliten zu erforschen, die für das Funktionieren der Mitochondrien wichtig sind.
