Bu protokol, yama kelepçesi tekniğinin, iç mitokondriyal membran boyunca mitokondriyal proton sızıntısını doğrudan ölçerek mitokondrinin termojenik kapasitesini incelemek için nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır. Proton akımının iç mitokondriyal membrandan doğrudan ölçülmesi, mitokondriyal termogenezden sorumlu moleküler mekanizmaların tanımlanmasına ve hassas bir şekilde karakterize edilmesine yardımcı olur. Bu teknik sadece iç mitokondriyal membran boyunca proton akımını ölçmekle kalmaz, aynı zamanda kalsiyum veya adenin nükleotidleri gibi metabolitler gibi mitokondriyal fonksiyon için önemli olan diğer iletkenlikleri de incelemeye izin verir.
Ötenazi fareyi sırtına yerleştirin ve saçları temizlemek ve ıslatmak için alkol püskürtün. Ardından, toraks üzerinde iki santimetrelik bir kesi yapın. Cildi cımbızla kavradıktan sonra, kalbi hayvanın göğsünden disseke edin ve tüm kanı beş mililitre soğuk izolasyon çözeltisi ile 10 mililitrelik bir beherde çıkarmak için durulayın.
Kalp kan izlerinden temizlendikten sonra, beş mililitre soğuk izolasyon tamponu içeren başka bir 10 mililitrelik beher'e aktarın ve ince parçalar halinde doğrayın. Ardından, buzla soğutulmuş 10 mililitrelik bir cam homojenizatöre aktarın. Buz üzerindeki önceden kesilmiş dokuyu dakikada 275 rotasyonluk kontrollü bir hızda altı yumuşak vuruşla homojenize etmek için bir baş üstü karıştırıcı kullanın.
Homojenatı 15 mililitrelik buz gibi soğuk konik bir tüpe aktarın ve çekirdekleri ve kırılmamış hücreleri peletlemek için dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 700 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı 15 mililitrelik taze bir tüpte toplayın ve buzun üzerine yerleştirin. Mitokondri içeren bir pelet elde etmek için süpernatantı 8.500 kez G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
Mitokondriyal peleti 3.8 mililitre buz gibi soğuk hipertonik mannitol tamponunda yeniden askıya alın ve mitokondriyal süspansiyonu buz üzerinde 10 ila 15 dakika inkübe edin. Mitokondriyal hipertonik mannitol süspansiyonunu Fransız basınının soğutulmuş bir mini basınç hücresine doldurun. Ardından, hücreyi Fransız basınına yerleştirin.
Ardından, Fransız basınının düşük modunu seçin ve süspansiyonu kahverengi yağ mitokondrisi için kadran üzerinde 110'da ve kalp mitokondrisi için 140'ta mini basınç hücresinden sıkıştırarak süspansiyonun mini basınç hücresinden saniyede yaklaşık bir damla oranında çıkmasını sağlayın. Damlaları 15 mililitrelik buzla soğutulmuş konik bir tüpte toplayın. Süspansiyonu dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 10, 500 kez G'de santrifüj yapın.
Mitoplast peletini 0,5 ila 2 mililitre buz gibi soğuk hipertonik potasyum klorür tamponunda yeniden askıya alın ve süspansiyonu buz üzerinde saklayın. Borosilikat cam filamentleri kayıt gününde bir mikropipet çektirici kullanarak çekin ve yüksek derecede tekrarlanabilirliğe sahip pipetler üretmek için kullanılan çektirme makinesine bir program ayarlayın. Çektirme makinesinin içine bir cam filaman yerleştirin ve bir borosilikat filamentten neredeyse iki özdeş yama pipeti elde etmek için çekin.
Pipetler, çektirmenin ısıtma kutusu filamentinin eskimesi nedeniyle çekme döngüleri arasında tutarsız hale geldiğinde programı ayarlayın. Pipetleri pipet parlatıcısının içine yerleştirin ve yakmak için ucu filamentin yakınına 100X büyütme altında yerleştirin. Filamenti tıkanmadan veya uç eğrisine zarar vermeden ısıtmak için ayak pedalına birkaç kez basın.
Pipetler 25 ila 35 megaohm arasında bir dirence sahip olana kadar cilalanarak TMA bazlı pipet çözeltisi ile doldurulduğunda elde edilir. Mitoplast yapışmasını azaltmak için% 0.1 jelatin ile ön inkübasyon kapağı kaymaları ve mitoplast süspansiyonunu biriktirmeden önce potasyum klorür banyo çözeltisi ile durulayın. Yaklaşık 35 mikrolitre konsantre mitoplast süspansiyonu 500 mikrolitre potasyum klorür banyosu çözeltisi ile karıştırarak ham bir seyreltme hazırlayın ve daha önce dört delikli bir plakanın kuyucuğuna yerleştirilmiş kapak fişlerine yerleştirin.
Mitoplastların örtü kaymasından aşağı doğru tortu oluşturması için 15 ila 20 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Banyo odasını yaklaşık 50 mikrolitre potasyum klorür banyosu çözeltisi ile tamamen doldurun ve bükülmüş uçlu ince mikrodiseksiyon cımbızları kullanarak oda içinde mitoplastlı bir kapak kayması aktarın. Mitoplastları kapak kayması üzerinde sabit tutmak için odayı delmeden kapak kaymasını odanın dibinde düzenleyin.
Kapak kaymasını mikroskop altında 60X hedefle tarayarak yapışkan olmayan bireysel bir mitoplast seçin. Pipete pipet çözeltisini yükleyin ve pipet tutucuya yerleştirin. Pipetleri bir mikromanipülatör ile banyo çözeltisine getirin ve İBB'ye yaklaşmak için seçilen mitoplastın hemen üzerine taşıyın.
Membran potansiyelini sıfır milivoltta tutun ve amplifikatör programındaki membran test komutunu kullanarak 10 milivolt darbeler uygulayın. İBB ile hızlı bir şekilde gigaseal oluşturmak için hafif bir negatif basınç uygulayın. Deney sırasında pipet sürüklenmesi nedeniyle conta kırılmasını önlemek amacıyla pipeti kapak kaymasından uzak tutmak için mitoplast takılı olarak pipeti kaldırın.
Kopma sonrası mitoplast membran için doğru bir kapasitans ölçümü elde etmek için tüm mitoplast konfigürasyonunu test etmeden önce amplifikatör programındaki membran test komutu ile başıboş kapasitans geçicilerini telafi edin. Cam pipetin altındaki membran yamasını yırtmak ve tüm mitoplast konfigürasyonunu elde etmek için amplifikatör programı ile kısa süreli voltaj darbeleri uygulayın. Kırılmadan sonra, membran kapasitansını ve erişim direncini değerlendirmek için kapasitans geçicilerini amplifikatör programının membran test seçeneğiyle eşleştirin.
Kırılmadan hemen sonra, potasyum klorür banyosu çözeltisini perfüzyon yoluyla bir HEPES banyo çözeltisi ile değiştirin. Amplifikatör programı ile 850 milisaniyelik bir rampa protokolü uygulayın. Voltaj rampası protokolünün uygulanması, UCP'lerin gerekli aktivatörleri olan eksojen yağ asitlerinin eklenmesi olmadan, kahverengi yağın IMM'si boyunca büyük genlikli bir proton akımı indükler.
Endojen membran yağ asidi ekstraksiyonu için UCP1 inhibitörü guanozin difosfat veya 10 milimolar metil beta siklodekstrin tarafından perfüzyondan sonra, artık akım, UCP1 eksikliği olan farelerin IMM'sinde tamamen kaybolan UCP1 akımlarının genliğini belirlemek için kullanılır. Kahverengi yağın aksine, iskelet kası ve kalp gibi yağ olmayan dokuların IMM'si, kırılmadan hemen sonra ölçülebilir bir proton akımı geliştirmez. AAC yoluyla ölçülebilir bir proton akımını indüklemek için, bir ila iki mikromolar eksojen yağ asidi içeren HEPES banyo çözeltisinin uygulanması esastır.
Ölçülen proton akımının AAC tarafından taşındığını doğrulamak için, AAC1 eksikliği olan farelerin IMM'sinde gösterilen proton akımını neredeyse tamamen inhibe eden spesifik inhibitörler, karboksiyatrilosit uygulamak önemlidir. Proton sızıntısının sabit ama asla tam bir inhibisyonu ancak AAC yoluyla aktif bir nükleotid değişimi oluşturmak için membranın her iki tarafında ADP mevcut olduğunda elde edilir. Mitoplast preparatının kalitesi, tüm mitoplast konfigürasyonuna ulaşmadaki başarı oranını etkileyecektir.
Bunu optimize etmek çok önemlidir. Mitokondriyal termogenezin moleküler mekanizması yama kelepçesi tekniği ile diseke edildikten sonra, mitokondriyal oksijen tüketiminin ölçülmesi, bozulmamış mitokondride proton akımının ve termojenezin önemini gösterecektir. Bu teknik, araştırmacıların mitokondrinin işleyişi için önemli olan her türlü iletkenliği, iyonu ve metaboliti keşfetmelerinin yolunu açar.
