Этот протокол позволяет пользователю достичь эффективной трансгенной экспрессии в желудочковом миокарде, облегчая исследования экспрессии генов для изучения сердечных аритмий и функции в желудочковой ткани. Метод экспрессии вирусных трансгенов является минимально инвазивным для животного, вызывая меньший ущерб и сокращая время восстановления, чем обычные подходы, которые включают торакотомию. Методика индуцирования аритмий в сердцах мелких грызунов полезна для оценки восприимчивости к аритмиям у мелких животных моделей сердечных заболеваний.
Продемонстрировать процедуру будет доктор Алиса Лу, постдокторант из лаборатории. Для начала стерилизуйте левую нижнюю часть грудной клетки анестезируемой мыши чередующимися раундами скраба на основе йода или хлоргексида в спирте три раза круговыми движениями. Под руководством ультразвуковой визуализации вставьте иглу шприца, содержащего вирус, в грудную клетку животного.
Подойдите кончиком иглы к левой передней свободной стенке желудочка и медленно введите от 10 до 15 микролитров вируса. Убедитесь в успешной инъекции в ультразвуковых изображениях по усиленной яркости возле кончика иглы. Извлеките иглу из сердца и вставьте в другие области левого желудочка для второй и третьей инъекции такое же количество вируса.
Чтобы выполнить перфузию сердца мыши по Лангендорфу, поместите канюлированное сердце в силиконово-эластомерную пластиковую посуду, покрытую 10-сантиметровым пластиком, с левым желудочком вверх. Каннулировать аорту сердца тупой иглой, подключенной к модифицированной системе изобилия Лангендорфа в режиме постоянного расхода. Наполните сердце раствором тирода с пузырьками кислорода при температуре 37 градусов Цельсия.
В начале перфузии проверьте правильную канюляцию аорты, наблюдая за вымыванием крови из сердца в течение первых двух-трех сердечных сокращений и изменяя цвет сердца с красного на бледный. Отрегулируйте скорость потока, чтобы поддерживать давление перфузии на уровне от 70 до 80 миллиметров ртутного столба. После подтверждения поместите электроды системы ЭКГ маленького животного вокруг сердца, вставив их в силиконово-эластомерное покрытие в чашке.
Затем запишите ЭКГ с помощью совместимого программного обеспечения. Далее выполняют стимуляцию адренергических рецепторов и перфузируют сердце изопротеренолом и раствором Тирода. Через 10 минут выполните запрограммированную электрическую стимуляцию, чтобы вызвать желудочковые тахиаритмии, стимулируя сердце на вершине двумя платиновыми электродами, подключенными к электрическому стимулятору.
Начните процедуру стимуляции с начальных 10 последовательных стимулов S1, за которыми последует дополнительный стимул S2 с начальным интервалом 80 миллисекунд. Затем многократно уменьшайте интервал S2 на две миллисекунды каждый раз, пока сердцебиение больше не может быть захвачено или не будет достигнут эффективный рефрактерный период сердца, или ERP. Контролировать любые индуцированные желудочковые тахиаритмии, включая желудочковую тахикардию и фибрилляцию, с помощью ЭКГ.
Если аритмии не индуцируются. добавить еще один дополнительный стимул, S3, после S2, с теми же параметрами до тех пор, пока не будет достигнут ERP. Если желудочковые тахиаритмии все еще не индуцированы, прекратите электрическую стимуляцию и считайте сердце неиндуцируемым.
Во время запрограммированной электрической стимуляции успешная кардиостимуляция проверяется индивидуальным захватом сердцебиения во время последовательных стимулов S1 и длительным комплексом QRS во время темпа S1. Эти комбинированные адренергические и электрические стимуляции не вызывали желудочковых тахиаритмий в здоровых, фиктивных сердцах мышей дикого типа или в сердцах крыс, введенных в контроль аденовирус-GFP. Напротив, тот же протокол индуцировал желудочковые тахиаритмии у 77% мышечных сердец дикого типа после инфаркта миокарда и у трех из четырех крыс после внутримиокардиальной инъекции Ad-Wnt3a.
При введении иглы убедитесь, что наконечник иглы встроен в свободную стенку, а не внутрь желудочка. Кроме того, закрепление и каннюляция аорты сердца является наиболее важным шагом. После этих процедур сердца могут быть использованы для стандартных гистологических исследований или молекулярно-биологических анализов.
Альтернативно, живые клетки могут быть выделены для выполнения одноклеточных электрофизиологических исследований.
