Гибкая технология камеры окружающей среды позволяет получать покадровую съемку в виде SRS с детектированием передаваемого сигнала на рамке операционного микроскопа. В микроскопии SRS использовался объектив с высокой числовой апертурой и конденсатор с высоким концом, оставляя всего несколько миллиметров зазора, в который не поместилась обычная камера. Гибкая камера решает эту проблему.
Исследователи, использующие микроскопию SRS, могут легко принять эту технику. Гибкая камера также может быть использована на препарирующем или стерильном микроскопе для поддержания образца в оптимальных физиологических условиях. Для начала отметьте расположение ножек рамы микроскопа SRS и моторизованного столика с помощью маркера на оптическом столе.
Сняв рамку микроскопа и предметный столик с оптического стола, положите лист силиконовой резины на стол. Разрежьте силиконовую резину вдоль следов с помощью ножа. Удалите мелкие кусочки резины и поместите квадратные керамические листы слюды в те же места.
Затем переместите рамку микроскопа и предметный столик обратно на оптический стол и аккуратно выровняйте ножки на листах слюдяной керамики вдоль линий маркера. После выравнивания оптического тракта SRS соберите экологический корпус поверх теплоизоляционного фундамента, чтобы покрыть всю раму микроскопа, используя пять кусков больших поликарбонатных листов. Заклейте края и стыки коробки с помощью ленты из алюминиевой фольги.
Подсоедините гибкий шланг воздуховода к впускному и выпускному отверстиям коробки корпуса, чтобы обеспечить циркуляцию теплого воздушного потока, перекачиваемого и контролируемого модулем нагревателя. Установите обработанную полую цилиндрическую алюминиевую деталь 1 на носовую часть объектива с помощью трех установочных винтов. Затем установите обработанную полую цилиндрическую алюминиевую деталь 2 на держатель образца с помощью четырех винтов.
Установите держатель образца с алюминиевой деталью 2 на моторизованный столик и установите его с помощью винтов. Поместите втулку из натуральной резиновой пленки между двумя обработанными алюминиевыми деталями и закрепите ее с помощью резинок на каждом конце. Подсоедините баллон со сжатым CO2 к модулю газового смесителя, используя соответствующие трубки и соединители.
Установите входное давление CO2 от 20 до 25 фунтов на квадратный дюйм. Используйте встроенный датчик CO2 и контроллер, чтобы модуль воздушного смесителя мог регулировать и смешивать 5% CO2 с воздушным потоком. Используйте встроенные фильтры для очистки воздушного потока.
Используя соответствующие трубки и соединители, направьте смешанный воздух в предварительно стерилизованную бутылку с водой, помещенную на конфорку, а затем направьте увлажненный воздух в гибкую камеру. Установите конфорку на 37 градусов по Цельсию. Пузырьки воздушного потока в теплой воде, чтобы увеличить влажность воздушного потока.
Отсоедините алюминиевую деталь машины 2 от держателя образца, открутив винты. Протрите все части гибкой камеры 70%-ным этанолом, включая носовую часть, держатель образца и объектив для погружения в воду. Обеззаразьте всю систему корпуса с помощью УФ-лампы, помещенной в корпус на 20-30 минут.
Затем загрузите чашку для культивирования клеток. Снимите крышку посуды и обездвижьте ее с помощью зажимов. Опустите объектив в питательную среду для грубой фокусировки.
Опустите алюминиевую деталь 2, чтобы закрыть гибкую камеру, и закрепите ее на держателе образца с помощью винтов. Затем вставьте датчик. Установите подачу воздуха с 5% CO2 и 19% O2 для нормальной культуры клеток со скоростью воздушного потока 200 кубических сантиметров в минуту и температурой 37 градусов по Цельсию.
Настройте длину волны лазера на 805 нанометров, чтобы нацелиться на обратный рамановский сдвиг 2 854 сантиметра, который объясняется вибрацией химических связей CH2. Используйте низкую мощность лазера, чтобы уменьшить фотоповреждение клеток. Отрегулируйте и сфокусируйте цель, чтобы добиться хорошей визуализации клеток SRS, используя кнопку фокусировки на главной панели управления программного обеспечения.
Чтобы выполнить быструю фокусировку, установите на панели конфигурации число пикселей 512 на 512 пикселей с временем выдержки пикселя 4,8 микросекунды. После достижения хорошей фокусировки установите разрешение изображения 2048 на 2048 пикселей для поля зрения 175 микрометров в квадрате для получения высококачественных изображений. Проверьте функцию сохранения на главной панели управления и проверьте канал SRS на панели каналов.
Установите интервал между двумя кадрами равным 180 секундам на канале основного управления. Установите номер сбора на 480 для покадровой съемки в течение 24 часов. Запустите автоматическое получение изображений с помощью функции петли на главной панели управления.
Была оценена производительность гибкой камерной системы для покадровой SRS-визуализации. Температура внутри корпуса микроскопа достигала ожидаемых 37 градусов по Цельсию и не оказывала существенного влияния на температуру в помещении. Температура в гибкой камере достигала 37 градусов по Цельсию за 1,5 часа и стабильно поддерживалась не менее 24 часов.
Относительная влажность в гибкой камере достигала 85% за один час и могла поддерживаться не менее 24 часов. Покадровая SRS-визуализация живых клеток SKOV3 показала быстрое и активное движение внутриклеточных липидных капель с временным разрешением три минуты. К концу 24-часового сеанса визуализации клетки все еще демонстрировали нормальную морфологию и плотность, что указывает на то, что клетки были здоровы.
Затем были визуализированы клетки SKOV3, обработанные олеиновой кислотой, и накопление липидных капель отслеживалось в течение 10 часов. Количество липидных капель определяли количественно с использованием соотношения липидных капель к площади тела клеток и общей интенсивности SRS липидных капель. Результаты показывают, что количество липидных капель продолжало увеличиваться в течение 10 часов.
Также была продемонстрирована одновременная прямая SRS-визуализация липидных капель и обратная двухфотонная флуоресцентная визуализация лизосом, меченных флуоресцентным красителем DND-189. Наблюдалась очень низкая степень колокализации липидных капель и лизосом. При попытке использовать этот протокол имейте в виду, что фокальный дрейф является распространенной проблемой при визуализации живых клеток.
Перефокусировка может потребоваться примерно через два часа покадровой съемки. После его разработки покадровая SRS-визуализация использовалась для различных исследований для отслеживания молекул без меток или меченых молекул с рамановским текстом в живых клетках.
