A técnica de câmara ambiental flexível permite time-lapse como imagem SRS com detecção de sinal transmitido em uma estrutura de microscópio cirúrgico. A microscopia SRS usou uma objetiva de abertura numérica alta e um condensador de alta extremidade, deixando apenas alguns milímetros de distância onde uma câmara convencional não pode se encaixar. Uma câmara flexível resolve esse problema.
Pesquisadores que utilizam a microscopia SRS podem facilmente adotar essa técnica. A câmara flexível também pode ser usada em um microscópio dissecante ou estéril para manter o espécime em condições fisiológicas ideais. Para começar, marque a localização dos pés da estrutura do microscópio SRS e do estágio motorizado usando uma caneta marcadora na mesa óptica.
Depois de remover a estrutura do microscópio e o estágio da mesa óptica, coloque a folha de borracha de silicone sobre a mesa. Corte a borracha de silicone ao longo das marcas usando uma faca. Retire pequenos pedaços de borracha e coloque as folhas de cerâmica de mica quadrada nos mesmos locais.
Em seguida, mova a estrutura do microscópio e o palco de volta para a mesa óptica e alinhe cuidadosamente os pés nas folhas de cerâmica de mica ao longo das linhas do marcador. Depois de realinhar o caminho óptico SRS, monte o gabinete ambiental no topo da fundação de isolamento térmico para cobrir toda a estrutura do microscópio, usando cinco peças de grandes folhas de policarbonato. Sele as bordas e interfaces da caixa usando fita de alumínio.
Conecte a mangueira flexível do duto às portas de entrada e saída da caixa do compartimento para permitir que o fluxo de ar quente circulado seja bombeado e controlado pelo módulo aquecedor. Monte a peça cilíndrica oca usinada de alumínio 1 na peça do nariz da objetiva usando três parafusos ajustados. Em seguida, monte a peça cilíndrica oca de alumínio usinada 2 no suporte da amostra usando quatro parafusos.
Encaixe o suporte de amostra com peça de alumínio 2 no palco motorizado e monte-o usando parafusos. Coloque a manga de película de borracha natural entre as duas peças de alumínio usinadas e monte-a usando elásticos em cada extremidade. Conecte o cilindro de CO2 comprimido ao módulo misturador de gás usando tubulação e conectores adequados.
Ajuste a pressão de entrada de CO2 em 20 a 25 psi. Use o sensor de CO2 integrado e um controlador para garantir que o módulo misturador de ar possa regular e misturar 5% de CO2 no fluxo de ar. Use filtros em linha para limpar o fluxo de ar.
Usando tubos e conectores adequados, guie o ar misturado até a garrafa de água pré-esterilizada colocada na placa de aquecimento e, em seguida, guie o ar umidificado para a câmara flexível. Ajuste a placa de aquecimento em 37 graus Celsius. Borbulhe o fluxo de ar na água morna para aumentar a umidade do fluxo de ar.
Desconecte a peça de alumínio 2 da máquina do suporte da amostra, removendo os parafusos. Limpe todas as partes da câmara flexível com etanol 70%, incluindo a peça do nariz, o suporte da amostra e a objetiva de imersão em água. Descontamine todo o sistema de compartimento usando uma lâmpada UV colocada no compartimento por 20 a 30 minutos.
Em seguida, carregue a placa de cultura celular. Retire a tampa do prato e imobilize-o com as pinças. Abaixe a objetiva no meio de cultura celular para focalização grosseira.
Abaixe a peça de alumínio 2 para fechar a câmara flexível e monte-a no suporte da amostra usando parafusos. Em seguida, insira o sensor. Ajuste o fornecimento de ar com 5%CO2 e 19%O2 para cultura celular normal com uma taxa de fluxo de ar de 200 centímetros cúbicos por minuto e temperatura de 37 graus Celsius.
Sintonize o comprimento de onda do laser para 805 nanômetros para atingir o deslocamento Raman inverso de 2.854 centímetros, que é atribuído à vibração das ligações químicas CH2. Use baixa potência do laser para reduzir os danos fotográficos às células. Ajuste e foque o objetivo de obter uma boa imagem SRS das células usando o botão de foco no painel de controles principal do software.
Para executar o foco rápido, defina o número de pixels para 512 por 512 pixels com um tempo de permanência de pixels de 4,8 microssegundos no painel de configuração. Depois de alcançar um bom foco, defina a resolução de imagem para 2048 por 2048 pixels para um campo de visão quadrado de 175 micrômetros para a aquisição de imagens de alta qualidade. Verifique a função salvar no painel de controles principal e verifique o canal SRS no painel de canais.
Defina o tempo de intervalo entre dois quadros como 180 segundos no canal de controles principal. Defina o número de aquisição como 480 para imagens de lapso de tempo em 24 horas. Inicie a aquisição automatizada de imagens usando a função de loop no painel de controles principal.
O desempenho do sistema de câmara flexível para imagens SRS time-lapse foi avaliado. A temperatura no interior do recinto ambiente do microscópio atingiu os 37 graus Celsius esperados e não afetou significativamente a temperatura ambiente. A temperatura na câmara flexível atingiu 37 graus Celsius em 1,5 horas e foi mantida estável por pelo menos 24 horas.
A umidade relativa do ar na câmara flexível atingiu 85% em uma hora e pôde ser mantida por pelo menos 24 horas. A imagem SRS de lapso de tempo de células SKOV3 vivas mostrou o movimento rápido e ativo de gotículas lipídicas intracelulares com uma resolução temporal de três minutos. Ao final da sessão de imagem de 24 horas, as células ainda apresentavam morfologia e densidade normais, indicando que as células estavam saudáveis.
Em seguida, células SKOV3 tratadas com ácido oleico foram fotografadas e o acúmulo de gotículas lipídicas foi rastreado ao longo de 10 horas. As quantidades de gotículas lipídicas foram quantificadas usando a razão entre gotículas lipídicas e área corporal celular e intensidade total de SRS das gotículas lipídicas. Os resultados indicam que a quantidade de gotículas lipídicas continuou aumentando ao longo de 10 horas.
Imagens simultâneas de SRS para frente de gotículas lipídicas e imagens de fluorescência de dois fótons para trás de lisossomos marcados com um corante de fluorescência DND-189 também foram demonstradas. Observou-se baixíssimo grau de colocalização de gotículas lipídicas e lisossomos. Ao tentar esse protocolo, tenha em mente que a deriva focal é um problema comum em imagens de células vivas.
O refoco pode ser necessário após cerca de duas horas de imagens de lapso de tempo. Após seu desenvolvimento, a imagem SRS de lapso de tempo tem sido usada para vários estudos para rastrear moléculas livres de rótulos ou moléculas marcadas com texto Raman em células vivas.
