柔軟な環境チャンバー技術により、手術中の顕微鏡フレーム上で送信信号を検出するSRSイメージングとしてタイムラプスが可能です。SRS顕微鏡は、高開口数対物レンズとハイエンドコンデンサーを使用し、従来のチャンバーでは収まらない数ミリメートルのギャップしか残しませんでした。柔軟なチャンバーはこの問題を解決します。
SRS顕微鏡を使用する研究者は、この技術を簡単に採用できます。フレキシブルチャンバーは、解剖顕微鏡や滅菌顕微鏡に使用して、標本を最適な生理学的条件下で維持することもできます。まず、SRS顕微鏡フレームの足の位置と電動ステージの位置を、光学テーブルのマーカーペンでマークします。
光学テーブルから顕微鏡フレームとステージを取り外した後、シリコーンゴムシートをテーブルに置きます。ナイフを使用してマークに沿ってシリコーンゴムを切ります。小さなゴム片を取り除き、正方形の雲母セラミックシートを同じ場所に置きます。
次に、顕微鏡フレームとステージを光学テーブルに戻し、マーカーラインに沿ってマイカセラミックシートに足を慎重に合わせます。SRS光路を再調整した後、5枚の大きなポリカーボネートシートを使用して、断熱基礎の上に環境エンクロージャを組み立てて顕微鏡フレーム全体をカバーします。アルミホイルテープを使用してボックスの端とインターフェースをシールします。
フレキシブルダクトホースをエンクロージャボックスの入口ポートと出口ポートに接続して、ヒーターモジュールによってポンプで送られて制御される循環式の暖かい空気の流れを可能にします。3本の止めネジを使用して、機械加工された中空の円筒形のアルミニウム片1を対物レンズのノーズピースに取り付けます。次に、機械加工された中空円筒状のアルミニウム片2を4本のネジを使用してサンプルホルダーに取り付ける。
アルミニウム片2のサンプルホルダーを電動ステージに取り付け、ネジを使用して取り付けます。天然ゴムフィルムスリーブを2つの機械加工されたアルミニウム片の間に置き、両端に輪ゴムを使用して取り付けます。適切なチューブとコネクタを使用して、圧縮されたCO2ボンベをガスミキサーモジュールに接続します。
CO2入力圧力を20〜25psiに設定します。内蔵のCO2センサーとコントローラーを使用して、エアミキサーモジュールが5%のCO2を調整して気流に混合できることを確認します。インライン フィルタを使用して、エアフローをクリーンアップします。
適切なチューブとコネクタを使用して、混合空気をホットプレートに置かれた滅菌済みのウォーターボトルに導き、加湿された空気をフレキシブルチャンバーに導きます。ホットプレートを摂氏37度に設定します。温水で気流を泡立てて、気流の湿度を上げます。
ネジを外して、機械のアルミニウム片2をサンプルホルダーから外します。ノーズピース、サンプルホルダー、水浸対物レンズなど、フレキシブルチャンバーのすべての部分を70%エタノールで拭きます。エンクロージャー内に20〜30分間置いたUVランプを使用して、エンクロージャシステム全体を除染します。
次に、細胞培養皿をロードします。皿のカバーを取り外し、クランプを使用して固定します。対物レンズを細胞培養培地に下げて、粗い焦点を合わせます。
アルミニウム片2を下げてフレキシブルチャンバーを囲み、ネジを使用してサンプルホルダーに取り付けます。次に、センサーを挿入します。通常の細胞培養では、5%CO2と19%O2の空気供給量を、空気流量を毎分200立方センチメートル、温度を摂氏37度に設定します。
レーザー波長を805ナノメートルに調整して、CH 2化学結合の振動に起因する2, 854センチメートルの逆ラマンシフトをターゲットにします。低レーザー出力を使用して、細胞への写真の損傷を減らします。ソフトウェアのメインコントロールパネルにあるフォーカスボタンを使用して、細胞の良好なSRSイメージングを実現するために、対物レンズを調整して焦点を合わせます。
高速フォーカスを実行するには、構成パネルでピクセル数を 512 x 512 ピクセル、ピクセル滞留時間を 4.8 マイクロ秒に設定します。良好なピント合わせを実現した後、高品質の画像を取得するために、175マイクロメートルの正方形の視野に対して、イメージング解像度を2048 x 2048ピクセルに設定します。メインコントロールパネルの保存機能を確認し、チャンネルパネルのSRSチャンネルを確認してください。
メインコントロールチャンネルで2つのフレーム間の間隔時間を180秒に設定します。取得番号を480に設定して、24時間以上のタイムラプスイメージングを行います。メインコントロールパネルのループ機能を使用して自動画像取得を開始します。
タイムラプスSRSイメージングのためのフレキシブルチャンバーシステムの性能を評価した。顕微鏡環境エンクロージャ内の温度は予想摂氏37度に達し、室温に大きな影響を与えませんでした。フレキシブルチャンバー内の温度は1.5時間で摂氏37度に達し、少なくとも24時間安定に維持されました。
フレキシブルチャンバー内の相対湿度は1時間で85%に達し、少なくとも24時間維持することができました。生きたSKOV3細胞のタイムラプスSRSイメージングは、3分間の時間分解能で細胞内脂肪滴の迅速かつ活発な動きを示しました。24時間のイメージングセッションの終わりまでに、細胞はまだ正常な形態と密度を示し、細胞が健康であることを示しています。
次に、オレイン酸で処理したSKOV3細胞を画像化し、脂肪滴の蓄積を10時間にわたって追跡した。脂肪滴量を、脂肪滴の細胞体面積比および総SRS強度に対する脂肪滴を用いて定量した。結果は、脂肪滴の量が10時間にわたって増加し続けたことを示しています。
脂肪滴の同時前方SRSイメージングと、蛍光色素DND-189で標識されたリソソームの後方2光子蛍光イメージングも実証されました。脂肪滴およびリソソームの非常に低い程度の共局在が観察された。このプロトコルを試みるときは、焦点ドリフトが生細胞イメージングの一般的な問題であることに注意してください。
約2時間のタイムラプスイメージング後に再フォーカスが必要になる場合があります。タイムラプスSRSイメージングは、その開発後、生細胞中のラベルフリー分子またはラマンテキストで標識された分子を追跡するためのさまざまな研究に使用されてきました。
