유연한 환경 챔버 기술은 작동 현미경 프레임에서 전송된 신호 감지를 통해 SRS 이미징으로 타임랩스를 가능하게 합니다. SRS 현미경은 높은 개구수 대물렌즈와 고급 콘덴서를 사용하여 기존 챔버가 들어갈 수 없는 몇 밀리미터의 간격만 남겼습니다. 유연한 챔버는 이 문제를 해결합니다.
SRS 현미경을 사용하는 연구원은 이 기술을 쉽게 채택할 수 있습니다. 유연한 챔버는 또한 최적의 생리학적 조건에서 표본을 유지하기 위해 해부 또는 멸균 현미경에 사용할 수 있습니다. 시작하려면 광학 테이블의 마커 펜을 사용하여 SRS 현미경 프레임과 전동 스테이지의 발 위치를 표시하십시오.
현미경 프레임과 s를 제거한 후tage 광학 테이블에서 실리콘 고무 시트를 테이블 위에 놓습니다. 칼을 사용하여 표시를 따라 실리콘 고무를 자릅니다. 작은 고무 조각을 제거하고 정사각형 운모 세라믹 시트를 같은 위치에 놓습니다.
그런 다음 현미경 프레임과 스테이지를 광학 테이블로 다시 이동하고 마커 라인을 따라 발을 운모 세라믹 시트에 조심스럽게 맞춥니다. SRS 광학 경로를 재정렬한 후 5개의 대형 폴리카보네이트 시트를 사용하여 전체 현미경 프레임을 덮도록 단열 기초 위에 환경 인클로저를 조립합니다. 알루미늄 호일 테이프를 사용하여 상자의 가장자리와 인터페이스를 밀봉합니다.
플렉시블 덕트 호스를 인클로저 상자의 입구 및 출구 포트에 연결하여 순환되고 따뜻한 공기 흐름이 히터 모듈에 의해 펌핑되고 제어되도록 합니다. 3개의 고정 나사를 사용하여 가공된 중공 원통형 알루미늄 조각 1을 대물렌즈의 노즈 피스에 장착합니다. 다음으로, 4개의 나사를 사용하여 가공된 중공 원통형 알루미늄 조각 2를 샘플 홀더에 장착합니다.
알루미늄 조각 2가 있는 샘플 홀더를 전동 스테이지에 장착하고 나사를 사용하여 장착합니다. 가공된 두 개의 알루미늄 조각 사이에 천연 고무 필름 슬리브를 놓고 양쪽 끝에 고무 밴드를 사용하여 장착합니다. 적절한 튜브와 커넥터를 사용하여 압축된 CO2 실린더를 가스 혼합기 모듈에 연결합니다.
CO2 입력 압력을 20-25psi로 설정합니다. 내장된 CO2 센서와 컨트롤러를 사용하여 에어 믹서 모듈이 5%CO2를 조절하고 공기 흐름에 혼합할 수 있는지 확인합니다. 인라인 필터를 사용하여 공기 흐름을 청소하십시오.
적절한 튜브와 커넥터를 사용하여 혼합 공기를 핫플레이트에 놓인 사전 멸균된 물병으로 안내한 다음 가습된 공기를 유연한 챔버로 안내합니다. 핫플레이트를 섭씨 37도로 설정합니다. 따뜻한 물에 공기 흐름을 거품을 일으켜 공기 흐름의 습도를 높입니다.
s에서 기계 알루미늄 조각 2를 분리합니다.amp나사를 제거하여 홀더. 노즈 피스를 포함하여 플렉시블 챔버의 모든 부분을 70% 에탄올로 닦습니다.ample 홀더 및 물 담그기 목표. UV 램프를 사용하여 전체 인클로저 시스템의 오염을 제거합니다.amp 인클로저에 20-30분 동안 배치합니다.
그런 다음 세포 배양 접시를 넣습니다. 접시의 덮개를 제거하고 클램프를 사용하여 고정하십시오. 대략적으로 초점을 맞추기 위해 대물렌즈를 세포 배양 배지로 내립니다.
알루미늄 조각 2를 내려 유연한 챔버를 둘러싸고 나사를 사용하여 샘플 홀더에 장착합니다. 그런 다음 센서를 삽입합니다. 일반 세포 배양을 위해 5% CO2 및 19% O2로 공기 공급을 분당 200입방센티미터의 공기 흐름 속도와 섭씨 37도로 설정합니다.
레이저 파장을 805 나노 미터로 조정하여 CH2 화학 결합의 진동에 기인하는 2, 854 센티미터 역 라만 시프트를 목표로합니다. 낮은 레이저 출력을 사용하여 세포의 사진 손상을 줄입니다. 소프트웨어의 기본 컨트롤 패널에 있는 초점 버튼을 사용하여 세포의 우수한 SRS 이미징을 얻을 수 있도록 대물렌즈를 조정하고 초점을 맞춥니다.
빠른 초점을 맞추려면 구성 패널에서 픽셀 번호를 512 x 512 픽셀로 설정하고 픽셀 유지 시간을 4.8마이크로초로 설정합니다. 초점을 잘 맞춘 후 고품질 이미지를 획득하기 위해 이미징 해상도를 2048마이크로미터 제곱 화각에 대해 2048 x 175 픽셀로 설정합니다. 메인 컨트롤 패널에서 저장 기능을 확인하고 채널 패널에서 SRS 채널을 확인합니다.
메인 컨트롤 채널에서 두 프레임 사이의 간격 시간을 180초로 설정합니다. 24시간 이상의 타임랩스 이미징을 위해 획득 번호를 480으로 설정합니다. 메인 컨트롤 패널의 루프 기능을 사용하여 자동 이미징 획득을 시작합니다.
타임랩스 SRS 이미징을 위한 플렉시블 챔버 시스템의 성능을 평가하였다. 현미경 환경 인클로저 내부의 온도는 예상 섭씨 37도에 도달했으며 실온에 큰 영향을 미치지 않았습니다. 플렉시블 챔버의 온도는 1.5 시간 만에 섭씨 37도에 도달했으며 최소 24 시간 동안 안정적으로 유지되었습니다.
가동 가능한 약실에 있는 상대 습도는 1 시간 동안 85%를 도달하고 적어도 24 시간 동안 유지될 수 있었습니다. 살아있는 SKOV3 세포의 타임 랩스 SRS 이미징은 3 분의 시간 분해능으로 세포 내 지질 방울의 빠르고 활동적인 움직임을 보여주었습니다. 24시간 이미징 세션이 끝날 때까지 세포는 여전히 정상적인 형태와 밀도를 보였으며 이는 세포가 건강했음을 나타냅니다.
다음으로, 올레산을 처리한 SKOV3 세포를 영상화하고, 10시간에 걸쳐 지질 액적 축적을 추적하였다. 지질 액적의 양은 지질 액적 대 세포체 면적 비율 및 지질 액적의 총 SRS 강도를 사용하여 정량화하였다. 결과는 지질 방울의 양이 10시간 동안 계속 증가했음을 나타냅니다.
형광 염료 DND-189로 표지된 리소좀의 지질 방울의 동시 순방향 SRS 이미징 및 후방 2광자 형광 이미징도 입증되었습니다. 지질 방울과 리소좀의 매우 낮은 정도의 공동 국소화가 관찰되었습니다. 이 프로토콜을 시도할 때 초점 드리프트는 라이브 셀 이미징에서 일반적인 문제라는 점을 명심하십시오.
약 2시간의 타임랩스 이미징 후에 초점을 다시 맞춰야 할 수 있습니다. 개발 후, 타임랩스 SRS 이미징은 살아있는 세포에서 라벨이 없는 분자 또는 라만 텍스트가 있는 라벨링된 분자를 추적하기 위한 다양한 연구에 사용되었습니다.
