La technique flexible de la chambre environnementale permet l’imagerie en accéléré en tant que SRS avec détection de signal transmis sur un cadre de microscope opératoire. La microscopie SRS utilisait un objectif à grande ouverture numérique et un condensateur haut de gamme, ne laissant que quelques millimètres d’espace là où une chambre conventionnelle ne peut pas s’adapter. Une chambre flexible résout ce problème.
Les chercheurs utilisant la microscopie SRS peuvent facilement adopter cette technique. La chambre flexible peut également être utilisée sur un microscope à dissection ou stérile pour maintenir l’échantillon dans des conditions physiologiques optimales. Pour commencer, marquez l’emplacement des pieds du cadre du microscope SRS et de la platine motorisée à l’aide d’un marqueur sur la table optique.
Après avoir retiré le cadre et la scène du microscope de la table optique, posez la feuille de caoutchouc de silicone sur la table. Couper le caoutchouc de silicone le long des marques à l’aide d’un couteau. Retirez les petits morceaux de caoutchouc et placez les feuilles carrées de céramique de mica aux mêmes endroits.
Déplacez ensuite le cadre du microscope et la platine vers la table optique et alignez soigneusement les pieds sur les feuilles de céramique de mica le long des lignes de marqueur. Après avoir réaligné le chemin optique SRS, assemblez l’enceinte environnementale au-dessus de la fondation d’isolation thermique pour couvrir l’ensemble du cadre du microscope, en utilisant cinq morceaux de grandes feuilles de polycarbonate. Scellez les bords et les interfaces de la boîte à l’aide de ruban adhésif en aluminium.
Connectez le tuyau flexible du conduit aux orifices d’entrée et de sortie de la boîte de boîtier pour permettre un flux d’air chaud circulant pompé et contrôlé par le module de chauffage. Montez la pièce cylindrique creuse usinée 1 sur la pièce avant de l’objectif à l’aide de trois vis de jeu. Ensuite, montez la pièce d’aluminium cylindrique creuse usinée 2 sur le porte-échantillon à l’aide de quatre vis.
Installez le porte-échantillon avec la pièce en aluminium 2 sur la platine motorisée et montez-le à l’aide de vis. Placez le manchon du film de caoutchouc naturel entre les deux pièces d’aluminium usinées et montez-le à l’aide d’élastiques à chaque extrémité. Connectez la bouteille de CO2 comprimée au module mélangeur de gaz à l’aide de tubes et de connecteurs appropriés.
Réglez la pression d’entrée de CO2 à 20 à 25 psi. Utilisez le capteur de CO2 intégré et un contrôleur pour vous assurer que le module mélangeur d’air peut réguler et mélanger 5% de CO2 dans le flux d’air. Utilisez des filtres en ligne pour nettoyer le flux d’air.
À l’aide de tubes et de connecteurs appropriés, guidez l’air mélangé vers la bouteille d’eau préstérilisée placée sur la plaque chauffante, puis guidez l’air humidifié vers la chambre flexible. Réglez la plaque chauffante à 37 degrés Celsius. Faites des bulles sur le flux d’air dans l’eau chaude pour augmenter l’humidité du flux d’air.
Déconnectez la pièce d’aluminium 2 de la machine du porte-échantillon en retirant les vis. Essuyez toutes les parties de la chambre flexible avec de l’éthanol à 70 %, y compris l’embout nasal, le porte-échantillon et l’objectif de trempage dans l’eau. Décontaminez l’ensemble du système d’enceinte à l’aide d’une lampe UV placée dans l’enceinte pendant 20 à 30 minutes.
Ensuite, chargez la boîte de culture cellulaire. Retirez le couvercle du plat et immobilisez-le à l’aide des pinces. Abaissez l’objectif dans le milieu de culture cellulaire pour une focalisation grossière.
Abaissez la pièce d’aluminium 2 pour enfermer la chambre flexible et montez-la sur le porte-échantillon à l’aide de vis. Insérez ensuite le capteur. Réglez l’alimentation en air avec 5% CO2 et 19% O2 pour une culture cellulaire normale avec un débit d’air de 200 centimètres cubes par minute et une température de 37 degrés Celsius.
Réglez la longueur d’onde du laser à 805 nanomètres pour cibler le décalage Raman inverse de 2 854 centimètres, attribué à la vibration des liaisons chimiques CH2. Utilisez une faible puissance laser pour réduire les dommages causés par la photo aux cellules. Ajustez et concentrez l’objectif pour obtenir une bonne imagerie SRS des cellules à l’aide du bouton de mise au point situé sur le panneau de commande principal du logiciel.
Pour effectuer une mise au point rapide, définissez le nombre de pixels sur 512 x 512 pixels avec un temps d’attente de pixels de 4,8 microsecondes sur le panneau de configuration. Après avoir obtenu une bonne mise au point, définissez la résolution d’imagerie sur 2048 par 2048 pixels pour un champ de vision carré de 175 micromètres pour l’acquisition d’images de haute qualité. Vérifiez la fonction d’enregistrement sur le panneau de commande principal et vérifiez le canal SRS sur le panneau des canaux.
Définissez l’intervalle de temps entre deux images sur 180 secondes sur le canal de contrôle principal. Définissez le nombre d’acquisition sur 480 pour l’imagerie accélérée sur 24 heures. Démarrez l’acquisition automatisée d’images à l’aide de la fonction de boucle sur le panneau de commande principal.
La performance du système de chambre flexible pour l’imagerie SRS en accéléré a été évaluée. La température à l’intérieur de l’enceinte environnementale du microscope a atteint les 37 degrés Celsius attendus et n’a pas affecté de manière significative la température ambiante. La température dans la chambre flexible a atteint 37 degrés Celsius en 1,5 heure et a été maintenue de manière stable pendant au moins 24 heures.
L’humidité relative dans la chambre flexible a atteint 85% en une heure et a pu être maintenue pendant au moins 24 heures. L’imagerie SRS en accéléré de cellules SKOV3 vivantes a montré le mouvement rapide et actif des gouttelettes lipidiques intracellulaires avec une résolution temporelle de trois minutes. À la fin de la séance d’imagerie de 24 heures, les cellules présentaient toujours une morphologie et une densité normales, indiquant que les cellules étaient saines.
Ensuite, les cellules SKOV3 traitées avec de l’acide oléique ont été imagées et l’accumulation de gouttelettes lipidiques a été suivie pendant 10 heures. Les quantités de gouttelettes lipidiques ont été quantifiées à l’aide du rapport entre les gouttelettes lipidiques et la surface corporelle cellulaire et de l’intensité totale du SRS des gouttelettes lipidiques. Les résultats indiquent que la quantité de gouttelettes lipidiques a continué d’augmenter pendant 10 heures.
L’imagerie SRS directe simultanée de gouttelettes lipidiques et l’imagerie par fluorescence à deux photons en arrière de lysosomes marqués avec un colorant de fluorescence DND-189 ont également été démontrées. Un très faible degré de colocalisation des gouttelettes lipidiques et des lysosomes a été observé. Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que la dérive focale est un problème courant dans l’imagerie de cellules vivantes.
La refocalisation peut être nécessaire après environ deux heures d’imagerie accélérée. Après son développement, l’imagerie SRS time-lapse a été utilisée pour diverses études afin de suivre des molécules sans marquage ou des molécules marquées avec du texte Raman dans des cellules vivantes.
