La tecnica flessibile della camera ambientale consente l'imaging time-lapse come SRS con rilevamento del segnale trasmesso su un telaio del microscopio operatorio. La microscopia SRS ha utilizzato un obiettivo ad alta apertura numerica e un condensatore di fascia alta, lasciando solo pochi millimetri di spazio dove una camera convenzionale non può adattarsi. Una camera flessibile risolve questo problema.
I ricercatori che utilizzano la microscopia SRS possono facilmente adottare questa tecnica. La camera flessibile può essere utilizzata anche su un microscopio da dissezione o sterile per mantenere il campione in condizioni fisiologiche ottimali. Per iniziare, segnare le posizioni dei piedi del telaio del microscopio SRS e del palcoscenico motorizzato usando una pennarello sul tavolo ottico.
Dopo aver rimosso il telaio e il palcoscenico del microscopio dal tavolo ottico, posare il foglio di gomma siliconica sul tavolo. Tagliare la gomma siliconica lungo i segni usando un coltello. Rimuovere piccoli pezzi di gomma e posizionare i fogli quadrati di ceramica mica nelle stesse posizioni.
Quindi spostare la cornice del microscopio e il palco sul tavolo ottico e allineare con attenzione i piedini sui fogli di ceramica mica lungo le linee di marcatore. Dopo aver riallineato il percorso ottico SRS, assemblare l'involucro ambientale sopra la fondazione di isolamento termico per coprire l'intero telaio del microscopio, utilizzando cinque pezzi di grandi lastre di policarbonato. Sigillare i bordi e le interfacce della scatola utilizzando nastro di alluminio.
Collegare il tubo flessibile del condotto alle porte di ingresso e di uscita della scatola della custodia per consentire il flusso di aria calda di circolazione pompato e controllato dal modulo riscaldatore. Montare il pezzo cilindrico cilindrico in alluminio lavorato 1 sul nasello dell'obiettivo utilizzando tre viti di fissaggio. Quindi, montare il pezzo cilindrico cilindrico cilindrico 2 lavorato sul supporto del campione utilizzando quattro viti.
Montare il portacampioni con il pezzo 2 in alluminio sul palco motorizzato e montarlo utilizzando viti. Posizionare il manicotto del film di gomma naturale tra i due pezzi di alluminio lavorati e montarlo utilizzando elastici a ciascuna estremità. Collegare la bombola di CO2 compressa al modulo miscelatore di gas utilizzando tubi e connettori appropriati.
Impostare la pressione di ingresso della CO2 da 20 a 25 psi. Utilizzare il sensore di CO2 integrato e un controller per garantire che il modulo miscelatore dell'aria possa regolare e miscelare il 5% di CO2 nel flusso d'aria. Utilizzare filtri in linea per pulire il flusso d'aria.
Utilizzando tubi e connettori adeguati, guidare l'aria miscelata verso la bottiglia d'acqua pre-sterilizzata posizionata sulla piastra riscaldante e quindi guidare l'aria umidificata verso la camera flessibile. Impostare la piastra riscaldante a 37 gradi Celsius. Bolle il flusso d'aria nell'acqua calda per aumentare l'umidità del flusso d'aria.
Scollegare il pezzo di alluminio della macchina 2 dal portacampioni rimuovendo le viti. Pulire tutte le parti della camera flessibile con etanolo al 70%, incluso il nasello, il supporto del campione e l'obiettivo di immersione dell'acqua. Decontaminare l'intero sistema di custodia utilizzando una lampada UV posizionata nella custodia per 20-30 minuti.
Quindi caricare il piatto di coltura cellulare. Rimuovere il coperchio del piatto e immobilizzarlo usando i morsetti. Abbassare l'obiettivo nei terreni di coltura cellulare per una messa a fuoco grossolana.
Abbassare il pezzo di alluminio 2 per racchiudere la camera flessibile e montarlo sul supporto del campione utilizzando viti. Quindi inserire il sensore. Impostare l'alimentazione d'aria con il 5% di CO2 e il 19% di O2 per la normale coltura cellulare con una portata d'aria di 200 centimetri cubici al minuto e una temperatura di 37 gradi Celsius.
Sintonizzare la lunghezza d'onda del laser a 805 nanometri per indirizzare lo spostamento Raman inverso di 2.854 centimetri, che è attribuito alla vibrazione dei legami chimici CH2. Utilizzare una bassa potenza laser per ridurre i danni fotografici alle cellule. Regolare e focalizzare l'obiettivo per ottenere una buona immagine SRS delle celle utilizzando il pulsante di messa a fuoco sul pannello di controllo principale del software.
Per eseguire una messa a fuoco rapida, impostate il numero di pixel su 512 x 512 pixel con un tempo di permanenza dei pixel di 4,8 microsecondi sul pannello di configurazione. Dopo aver ottenuto una buona messa a fuoco, impostare la risoluzione dell'immagine su 2048 per 2048 pixel per un campo visivo quadrato di 175 micrometri per l'acquisizione di immagini di alta qualità. Controllare la funzione di salvataggio sul pannello di controllo principale e controllare il canale SRS sul pannello dei canali.
Impostare il tempo di intervallo tra due fotogrammi su 180 secondi sul canale dei controlli principali. Impostare il numero di acquisizione su 480 per l'imaging time-lapse nell'arco di 24 ore. Avviare l'acquisizione automatica delle immagini utilizzando la funzione loop sul pannello di controllo principale.
Sono state valutate le prestazioni del sistema a camera flessibile per l'imaging SRS time-lapse. La temperatura all'interno dell'involucro ambientale del microscopio ha raggiunto i 37 gradi Celsius previsti e non ha influenzato in modo significativo la temperatura ambiente. La temperatura nella camera flessibile ha raggiunto i 37 gradi Celsius in 1,5 ore ed è stata mantenuta stabilmente per almeno 24 ore.
L'umidità relativa nella camera flessibile ha raggiunto l'85% in un'ora e potrebbe essere mantenuta per almeno 24 ore. L'imaging SRS time-lapse delle cellule SKOV3 vive ha mostrato il movimento rapido e attivo delle goccioline lipidiche intracellulari con una risoluzione temporale di tre minuti. Alla fine della sessione di imaging di 24 ore, le cellule mostravano ancora morfologia e densità normali, indicando che le cellule erano sane.
Successivamente, sono state visualizzate le cellule SKOV3 trattate con acido oleico e l'accumulo di goccioline lipidiche è stato monitorato nell'arco di 10 ore. Le quantità di goccioline lipidiche sono state quantificate utilizzando il rapporto tra goccioline lipidiche e area corporea cellulare e l'intensità SRS totale delle goccioline lipidiche. I risultati indicano che la quantità di goccioline lipidiche ha continuato ad aumentare per 10 ore.
È stato inoltre dimostrato l'imaging SRS simultaneo in avanti delle goccioline lipidiche e l'imaging a fluorescenza a due fotoni all'indietro dei lisosomi marcati con un colorante di fluorescenza DND-189. È stato osservato un grado molto basso di colocalizzazione delle goccioline lipidiche e dei lisosomi. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che la deriva focale è un problema comune nell'imaging di cellule vive.
Potrebbe essere necessaria una rimessa a fuoco dopo circa due ore di imaging time-lapse. Dopo il suo sviluppo, l'imaging SRS time-lapse è stato utilizzato per vari studi per tracciare molecole label-free o molecole marcate con testo Raman in cellule vive.
