La técnica flexible de cámara ambiental permite el lapso de tiempo como imágenes SRS con detección de señal transmitida en un marco de microscopio operativo. La microscopía SRS utilizó un objetivo de alta apertura numérica y un condensador de extremo alto, dejando solo unos pocos milímetros de espacio donde una cámara convencional no puede caber. Una cámara flexible resuelve este problema.
Los investigadores que utilizan la microscopía SRS pueden adoptar fácilmente esta técnica. La cámara flexible también se puede utilizar en un microscopio de disección o estéril para mantener la muestra en condiciones fisiológicas óptimas. Para comenzar, marque las ubicaciones de los pies del marco del microscopio SRS y la etapa motorizada con un rotulador en la mesa óptica.
Después de retirar el marco del microscopio y el escenario de la mesa óptica, coloque la lámina de goma de silicona sobre la mesa. Corte la goma de silicona a lo largo de las marcas con un cuchillo. Retire las piezas pequeñas de goma y coloque las láminas cuadradas de cerámica de mica en los mismos lugares.
Luego mueva el marco del microscopio y el escenario de nuevo a la mesa óptica y alinee cuidadosamente los pies sobre las láminas de cerámica de mica a lo largo de las líneas marcadoras. Después de realinear la trayectoria óptica SRS, ensamble el gabinete ambiental sobre la base de aislamiento térmico para cubrir todo el marco del microscopio, utilizando cinco piezas de láminas grandes de policarbonato. Selle los bordes y las interfaces de la caja con cinta de papel de aluminio.
Conecte la manguera de conducto flexible a los puertos de entrada y salida de la caja de la carcasa para permitir el flujo de aire caliente circulado bombeado y controlado por el módulo calentador. Monte la pieza cilíndrica de aluminio hueco mecanizada 1 en la pieza de la nariz del objetivo utilizando tres tornillos de fijación. A continuación, monte la pieza cilíndrica de aluminio hueca mecanizada 2 en el portamuestras con cuatro tornillos.
Coloque el portamuestras con la pieza de aluminio 2 en la platina motorizada y móntelo con tornillos. Coloque el manguito de la película de caucho natural entre las dos piezas de aluminio mecanizado y móntelo con bandas de goma en cada extremo. Conecte el cilindro de CO2 comprimido al módulo mezclador de gas utilizando tubos y conectores adecuados.
Ajuste la presión de entrada de CO2 de 20 a 25 psi. Utilice el sensor de CO2 incorporado y un controlador para garantizar que el módulo mezclador de aire pueda regular y mezclar un 5% de CO2 en el flujo de aire. Use filtros en línea para limpiar el flujo de aire.
Usando tubos y conectores adecuados, guíe el aire mezclado a la botella de agua preesterilizada colocada en la placa calefactora y luego guíe el aire humidificado a la cámara flexible. Ajuste la placa calefactora a 37 grados centígrados. Burbujee el flujo de aire en el agua tibia para aumentar la humedad del flujo de aire.
Desconecte la pieza de aluminio 2 de la máquina del portamuestras retirando los tornillos. Limpie todas las partes de la cámara flexible con etanol al 70%, incluida la pieza de la nariz, el soporte de la muestra y el objetivo de inmersión en agua. Descontamine todo el sistema de la carcasa utilizando una lámpara UV colocada en la carcasa durante 20 a 30 minutos.
Luego cargue la placa de cultivo celular. Retire la tapa del plato e inmovilícelo con las abrazaderas. Baje el objetivo en los medios de cultivo celular para un enfoque grueso.
Baje la pieza de aluminio 2 para encerrar la cámara flexible y móntela en el portamuestras con tornillos. A continuación, inserte el sensor. Ajuste el suministro de aire con 5% CO2 y 19% O2 para cultivo celular normal con un caudal de aire de 200 centímetros cúbicos por minuto y temperatura a 37 grados centígrados.
Sintoniza la longitud de onda del láser a 805 nanómetros para apuntar al desplazamiento Raman inverso de 2.854 centímetros, que se atribuye a la vibración de los enlaces químicos CH2. Utilice baja potencia láser para reducir el daño fotográfico a las células. Ajuste y enfoque el objetivo para lograr una buena imagen SRS de las células utilizando el botón de enfoque en el panel de controles principal del software.
Para realizar un enfoque rápido, establezca el número de píxeles en 512 por 512 píxeles con un tiempo de permanencia de píxeles de 4,8 microsegundos en el panel de configuración. Después de lograr un buen enfoque, establezca la resolución de imagen en 2048 por 2048 píxeles para un campo de visión cuadrado de 175 micrómetros para la adquisición de imágenes de alta calidad. Compruebe la función de guardar en el panel de control principal y compruebe el canal SRS en el panel de canales.
Establezca el intervalo de tiempo entre dos fotogramas para que sea de 180 segundos en el canal de controles principal. Establezca el número de adquisición en 480 para imágenes de lapso de tiempo durante 24 horas. Inicie la adquisición automatizada de imágenes utilizando la función de bucle en el panel de control principal.
Se evaluó el rendimiento del sistema de cámara flexible para imágenes SRS de lapso de tiempo. La temperatura dentro del recinto ambiental del microscopio alcanzó los 37 grados centígrados esperados y no afectó significativamente la temperatura ambiente. La temperatura en la cámara flexible alcanzó los 37 grados centígrados en 1,5 horas y se mantuvo estable durante al menos 24 horas.
La humedad relativa en la cámara flexible alcanzó el 85% en una hora y pudo mantenerse durante al menos 24 horas. Las imágenes SRS de lapso de tiempo de células SKOV3 vivas mostraron el movimiento rápido y activo de las gotas de lípidos intracelulares con una resolución temporal de tres minutos. Al final de la sesión de imágenes de 24 horas, las células todavía mostraban morfología y densidad normales, lo que indica que las células estaban sanas.
A continuación, se obtuvieron imágenes de las células SKOV3 tratadas con ácido oleico y se realizó un seguimiento de la acumulación de gotas de lípidos durante 10 horas. Las cantidades de gotas de lípidos se cuantificaron utilizando la relación gota de lípidos a área corporal celular y la intensidad SRS total de las gotas de lípidos. Los resultados indican que la cantidad de gotas de lípidos siguió aumentando durante 10 horas.
También se demostraron imágenes SRS simultáneas hacia adelante de gotas de lípidos e imágenes de fluorescencia de dos fotones hacia atrás de lisosomas marcados con un colorante de fluorescencia DND-189. Se observó un grado muy bajo de colocalización de gotitas lipídicas y lisosomas. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que la desviación focal es un problema común en las imágenes de células vivas.
Es posible que sea necesario volver a enfocar después de aproximadamente dos horas de imágenes de lapso de tiempo. Después de su desarrollo, las imágenes SRS de lapso de tiempo se han utilizado para varios estudios para rastrear moléculas sin etiquetas o moléculas marcadas con texto Raman en células vivas.
