Этот протокол демонстрирует микротекстурную чашку для культуры клеток, разработанную для роста сотен органоидов со знанием материала и полностью совместимую с микроскопией. Наша методика эффективно позволяет генерировать тысячи органоидов, полностью совместимых с долгосрочной визуализацией и долгосрочной клеточной культурой. Этот протокол представляет большой интерес для биомедицинских приложений, таких как конвейер скрининга лекарств и области исследований рака.
Методика, представленная в этом протоколе, легко освоить после нескольких попыток любого, кто имеет опыт работы с лабораторными процедурами и оптической микроскопией. Для начала отрежьте небольшие участки формы PDMS до размера, необходимого для конечного устройства. Вырежьте их параллельно направлениям XY массива.
Поместите один из подготовленных кубиков формы PDMS лицевой стороной вниз на плоскую секцию PDMS. Затем, используя пипетку, добавьте примерно от 0,1 до 0,2 миллилитров УФ-отверждаемого клея на одну сторону формы. Следите за прогрессированием жидкости внутри полости с помощью перевернутого оптического микроскопа при 10-кратном увеличении.
Подвергайте клей воздействию ультрафиолетового света, чтобы вылечить его. Отрегулируйте время экспозиции в зависимости от плотности мощности УФ-источника, как описано в тексте рукописи. Используя избыточное количество клея на одном краю, удерживайте отвержденный клей на плоской подложке PDMS, осторожно надавливая на нее пальцем.
Между тем, используя пинцет, зажмите один угол формы рядом с тем же удерживаемым краем и медленно отклейте форму, гарантируя, что текстурированная пленка не будет поднята. Обрежьте избыток клея и подложки PDMS с помощью лезвия бритвы, чтобы оставить отвержденный, текстурированный и клеевой слой плоским на PDMS с избыточной подложкой только на одном краю. Обработайте чистый покров коротким процессом кислородной плазмы, чтобы улучшить его гидрофильность.
После плазменной активации отжим покройте тонкий слой УФ-отверждаемого клея, поместив крышку на вакуумный патрон стандартного спин-коатера и вылив небольшую каплю клея в центр крышки. Запустите процесс спинового покрытия, как описано в текстовой рукописи. Если спиновое покрытие недоступно, опустите примерно 0,1 миллилитра УФ-отверждаемого клея на чистый покров с помощью пипетки.
Возьмите вторую крышку и поместите ее поверх первой, чтобы жидкий клей равномерно распределился между двумя крышками. Как только клей достигнет края обшивки, аккуратно отделите их, скользя один над другим. После разделения оба покрова будут полностью покрыты тонким слоем жидкого клея.
После спинового покрытия предварительно отверждайте клей воздействием ультрафиолета. Отрегулируйте время воздействия в зависимости от плотности мощности используемого УФ-источника. Возьмите одну из текстурированных пленок и поместите ее в контакт с клейким покрытием. Убедитесь, что контакт между частично отвержденным клеем и текстурированной пленкой максимально равномерным.
На этом этапе клей на крышке должен быть достаточно твердым, чтобы избежать повторного перетекания, а контакт можно оптимизировать, осторожно надавливая на крышку. Подвергайте крышки воздействию ультрафиолетового излучения до полного отверждения слоя клея с покрытием. Это запечатает текстурированную пленку на крышке и обеспечит герметичную изоляцию между полостями периметра.
Затем, используя пинцет, зажмите PDMS на краю, где после обрезки остался лишний материал, и отклейте плоскую подложку PDMS. Этот шаг позволяет текстурированному слою пленки прилипать к крышке с открытым доступом в верхней части для посева клеток. Перед посевом клеток на устройстве, пассивированном биометрическим сополимером, как описано в рукописи, дозируют один миллилитр стерильного PBS в 35-миллиметровую клеточную культуру чашки Петри.
Дегазируйте блюдо со стерильным PBS с помощью вакуумной камеры в течение 10 минут, после чего следует несколько раундов пипетки, чтобы удалить все пузырьки. Замените PBS стерильной питательной средой и стерилизуйте пластину ультрафиолетовым светом в течение 30 минут под капюшоном клеточной культуры. Приготовьте клеточную суспензию, следуя рекомендациям по трипсинизации или клеточной суспензии для интересующих клеток, как описано в текстовой рукописи.
Подсчитайте и отрегулируйте концентрацию клеток до 500 000 клеток на миллилитр в рекомендуемой среде культивирования клеток. Извлеките буфер PBS из 35-миллиметровой чашки для культивирования клеток, а затем дозируйте один миллилитр отрегулированной клеточной суспензии. Поместите чашку для посева клеток обратно в клеточный инкубатор на 10 минут.
Примерно от 80 до 100 ячеек войдут в каждую полость периметра. Примерно через 10 минут инкубации извлеките чашку для культивирования клеток из инкубатора и осторожно аспирируйте клеточную суспензию, чтобы удалить непопадающие клетки. Добавьте один миллилитр питательной среды в чашку для культивирования и поместите его обратно в клеточный инкубатор.
По желанию, чтобы извлечь органоиды после того, как они выросли в колодцах, зажмите текстурированный клеевой слой на кромке среза с помощью пинцета и аккуратно отклейте его от стеклянной крышки, но держите его погруженным в среду. Увеличение концентрации биометрического сополимера увеличивало толщину покрытия. Полная дегазация посуды для клеточных культур была необходима для удаления пузырьков воздуха, захваченных в полостях периметра.
Органоиды образовались после второго и 15 дней культивирования. Конфокальная микроскопия вращающегося диска показала репрезентативные изображения органоидов и 3D-реконструкцию. При приготовлении блюда для культуры важно обращать внимание на сборку формы или стопки подложки и обеспечивать хороший контакт между текстурированной пленкой и крышкой.
Сдерживание, обеспечиваемое нашими микрополитами, и отсутствие потери материала привлекли внимание исследователей космической биологии, заинтересованных в изучении влияния микрогравитации на органоидный гомеостаз.
