Протокол позволяет проводить мутационные оценки микробов. Он может продемонстрировать, как организмы окружающей среды контексте эффекты вероятность спонтанной мутации. Основным преимуществом этого протокола является то, что он дешевый и эффективный.
Параллельно можно сделать множество оценок скорости мутаций. Мутации, которые измеряет этот протокол, могут последовать за устойчивостью к антибиотикам. Таким образом, этот протокол может быть использован для изучения одной из самых больших проблем в мире, устойчивости к противомикробным препаратам.
Этот метод может дать представление о том, как экологический контекст клеток может понять эволюцию устойчивости к противомикробным препаратам. Этот протокол оценивает мутационные показатели в монокультуре лабораторного штамма, но мы применили его к клиническим штаммам и совместной культуре двух штаммов, чтобы различать бионейтралевую молекулу. Наиболее опасными реакциями, используемыми в этом протоколе, являются антибиотик рифампицин и метанол.
Поэтому не забудьте использовать защитные перчатки и очки, когда рифампицин растворяется в метаноле. Для начала этой процедуры прививают три мл жидкого лизогенного бульона со царапиной льда из запасов глицерола E.coli K12. Встряхните культуру LB при 120 об/мин и при 37 градусах по Цельсию в течение примерно семи часов.
После этого разбавьте культуру в 2000 раз солевым раствором. Добавить 10 мл жидкости Дэвис минимальной среде каждой трубки с каждой из которых содержит различные концентрации глюкозы, как показано здесь. Добавьте 100 микролитров разбавленной культуры в три 50 мл крышки экрана конические нижние полимерные трубки.
Подготовка 22 мл из пяти различных решений жидкости Дэвис минимальной среды с глюкозой, каждый в своей собственной 50 мл трубки, как наброски в текстовом протоколе. Чтобы подготовить инокулу для окружающей среды, сначала измерьте оптическую плотность ночных культур на уровне 600 нанометров. Разбавьте культуры солевым раствором и добавьте от 2200 до 110000 клеток в каждую среду.
Это гарантирует, что инокулум для одного мл окружающей среды содержит от 1000 до 5000 клеток. Далее, создать случайный макет параллельных культур для 196 глубокой пластины хорошо. Передача одного МЛ привитых средств массовой информации в каждом колодец пластины в соответствии с макетом.
Затем зафиксните крышку пластины лентой и взвесьте всю тарелку крышкой и лентой. Встряхните тарелку при 250 об/мин и при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов. После этого поместите два Л дистиллированной воды в инкубатор, чтобы стабилизировать количество испарения среди экспериментальных наборов.
Определите размер инокулума, потрогая 10 микролитров каждого из привитых средств массовой информации на неселективной пластине TA agar. Используйте стерильный L-образный распространитель до тех пор, пока поверхность агара не высохнет. Затем приготовьте селективный ТА-агар, содержащий рифампицин в шести пластинах.
Pipette 5 mL селективного agar TA в каждый наилучшим образом 6 плит наилучшим образом. Подсчитайте единицы формирования колонии на не селективных агарных пластинах и определите размер инокулы. После 24 часов инкубации, весят всю глубокую пластину хорошо, чтобы определить количество испарения, которое, вероятно, около 10%Передача трех случайно выбранных культур на анализ в помеченных микроцентрифуг труб.
Плита оставшихся 81 параллельных культур из глубокой пластины хорошо на селективный та-агар, содержащий рифампицин. Затем снимите крышки с селективных агарных пластин и оставьте их в стерильных условиях, чтобы высушить всю жидкость на поверхности агара. Определите количество единиц формирования колонии путем разбавления культур из микроцентрифугных труб с помощью пяти 10-кратных шагов разбавления путем смешивания и вихря 900 микролитров солевого раствора с 100 микролитров культуры на шаг разбавления.
Плита 40 микролитров окончательного разбавления на не селективном ТА-агаре и поместите крышку на пластины. Инкубировать ночь при 37 градусах по Цельсию. После того, как все колодцы на шести колодцах не будут иметь культурную жидкость, поместите крышку обратно.
Затем инкубировать пластины с крышкой на 37 градусов по Цельсию в течение 44-48 часов. На четвертый день подсчитывайте колонию, образуя единицы на не селективных агарных плитах. На пятый день подсчитайте количество колоний, устойчивых к антибиотикам на селективных тагарных пластинах.
Запись распределения между параллельными культурами наблюдаемого числа мутантов для конкретного анализа. Откройте соответствующее программное обеспечение на компьютере. Во вкладке тестирования гипотезы оставьте значения по умолчанию.
Нажмите просмотр и выберите текстовый файл с распределением наблюдаемых мутантов. После загрузки файла нажмите на выполненный тест. С правой стороны, по результатам теста, под одним образцом ML-теста, найти номер мутации.
Это м, ожидаемое количество мутационных событий. Затем оцените скорость мутации конкретного генотипа в конкретной среде как наброски в текстовом протоколе. Здесь показаны мутации MG1655 трех различных фенотипических маркеров, циклосерина, рифампицина и налидиксической кислоты.
Показатели мутаций оцениваются в минимальной среде Дэвиса с концентрацией глюкозы 80 мг/л, 125 мг/л и 250 мг/л. В одном случае используется концентрация глюкозы 1000 мг/л. Как и ожидалось, показатели мутаций выше для циклозеринной резистентности, самые низкие для устойчивости налидиксиновой кислоты, и скорость резистентности к рифампицину находится в середине.
Анализ колебаний ясно показывает, какой штамм является составным мутатором, а какой имеет нормальные показатели мутаций. Поскольку штамм mutT deletant имел скорость мутации к сопротивлению налидиксической кислоте, что примерно в 50 раз выше контрольного штамма MG1655. При предварительной форме этого протокола, убедитесь, что ваши клетки растут хорошо.
Они должны расти до равномерной плотности между параллельными культурами с той же окружающей средой. Одним из последующих действий к этой процедуре является определение последовательности ДНК гена rpoB в устойчивых колониях. Определить, как спектр мутаций к резистентности к рифампицину изменяется в зависимости от экологического микробного генотипа.
Колебания в 20-м веке показали, как мутация спонтанна и случайна с уважением к окружающей среде. Теперь они проливают новый свет на то, как скорость мутаций меняется в зависимости от окружающей среды генетически, экологически, даже социально.
