Иммунофлуоресценция LC3 позволяет определять уровни аутофагии в клетках поджелудочной железы. Это позволяет изучать потенциальное влияние различных агентов на аутофагию клеток поджелудочной железы. Иммунофлуоресценция - это метод, используемый для обнаружения эндогенного белка LC3, который позволяет избежать проблем, вызванных чрезмерной экспрессией LC3, таких как образование белковых агрегатов, не связанных с аутофагией.
Продемонстрируют процедуру Фелипе Ренна, аспирант, и Малена Эррера Лопес, аспирант лаборатории Марии Инес Ваккаро. Чтобы начать подготовку клеток, замочите 12-миллиметровые круглые покровные листы в абсолютном этаноле. Сняв крышку, поместите пропитанную крышку вертикально в 24-луночную пластину.
Подвергните многолуночную пластину ультрафиолетовому излучению в течение 15 минут. Затем установите защитное стекло горизонтально и промойте его ДМЭМ. Теперь посмотрите на низкое количество проходов клеток поджелудочной железы, повторно суспендированных в DMEM, содержащих 10% FBS, пенициллина и стрептомицина, и инкубируйте клетки в течение двух дней.
Через два дня после посева клеток приготовьте раствор гемцитабина в ДМЭМ в концентрации один микрограмм на микролитр. Затем аспирируйте половину объема из каждой лунки в отдельную пробирку и добавьте соответствующее количество раствора гемцитабина. Верните половину объема, соответствующую каждой лунке, обратно в обработанные лунки и инкубируйте клетки в течение 24 часов.
Для фиксации и проникновения клеток добавьте холодный метанол в 24-луночную пластину, содержащую клетки. Также подготовьте шестилуночную тарелку с холодным PBS. Используя иглу шприца и пинцет, возьмите каждый листок крышки и дважды промойте его в PBS.
Затем инкубировать в метаноле в течение шести минут. После двукратной промывки с помощью PBS инкубируйте покровные шликеры в блокирующем растворе в течение одного часа. Добавьте анти-LC3 в блокирующий раствор в соотношении один к 1000 и поддерживайте на льду.
Поместите кусок лабораторной герметизирующей пленки на многолуночную крышку и добавьте 25 микролитров раствора анти-LC3 на покровное стекло поверх герметизирующей пленки. Используя иглу шприца и пинцет, поместите каждую крышку на первичную каплю антитела, убедившись, что сторона клетки находится в контакте с раствором. Поместите многолуночную пластину в камеру влажности.
Накройте его фольгой и выдержите ночь в холодильнике. На следующий день извлеките многолуночную пластину из камеры влажности. Поместите пальцы крышки обратно на многолуночную пластину и промойте их PBS три раза.
Разбавьте флуоресцентно меченный антикролик в блокирующем растворе в соотношении один к 800 и держите на льду в темноте. После запечатывания многолуночной крышки добавьте 25 микролитров раствора против кролика на защитную пленку. И обработайте покровный листок вторичным антителом, как было продемонстрировано ранее.
Затем выдержите пластину во влажной камере в течение двух часов при комнатной температуре, защищенной от света. По окончании инкубации с антителами трижды промойте покровные листы на многолуночной пластине ПБС. Инкубируйте каждый покровный лист приготовленным раствором DAPI в течение 10 минут.
После промывки с помощью PBS держите многолуночную пластину в темноте. Для монтажа клеток подготовьте два стакана с водой и лист бумаги. Добавьте 10 микролитров раствора ПВА-ДАБКО на покровное стекло предметного стекла.
Промойте покровное стекло в воде, а затем высушите его на бумаге. Наконец, поместите его на каплю PVA-DABCO. И сушить на ночь в темноте.
На следующий день с помощью инвертированного конфокального микроскопа визуализируйте меченые клетки и сделайте снимки. После захвата изображений перетащите каждый файл изображения, содержащий захваченные каналы, на экран Фиджи. В диалоговом окне нажмите кнопку ОК, чтобы открыть изображение.
Затем закройте открывшееся окно консоли. На вкладке «Изображение» выберите «Цвет», а затем «Разделить каналы». Закройте изображение, соответствующее каналам, отличным от изображения LC3.
Затем на вкладке «Изображение» выберите «Настроить», а затем «Цветовой баланс». Перемещайте ползунок «Максимум» влево, пока изображение не насытится, чтобы визуализировать контуры ячеек. Используйте инструмент выделения от руки, чтобы нарисовать контур ячейки, и нажмите кнопку сброса, чтобы настроить цвета.
Чтобы вырезать выбранный элемент на вкладке «Правка», выберите «Вырезать» и закройте изображение, не сохраняя его. И на вкладке «Правка» выберите «Вставить». В меню «Анализ» выберите инструмент «Счетчик 3D-объектов».
Установите пороговое значение 2000, а фильтр по размеру — от 50 до 500. Убедитесь, что объекты и поля сводки помечены, и нажмите OK.In окне журнала, количество точек будет описано как обнаруженные объекты. Иммунофлуоресценция показала клеточное распределение белка LC3, тогда как DAPI показал ядерную локализацию в клетках поджелудочной железы.
Точки LC3 значительно увеличивались при лечении гемцитабином, что указывает на аутофагическую активность. При чрезмерном слиянии экзокринные клетки поджелудочной железы имеют тенденцию накапливаться и расти друг на друге. Метод фиксации клеток параформальдегида был неэффективен для сохранения белков LC3, так как не отражал точного распределения.
Когда фиксацию или обработку проводили, не дожидаясь двух дней после посева, клетки PANC1 имели круглую форму. Эта морфология уменьшала связь между цитоплазмой и ядром, что затрудняло понимание внутриклеточного распределения LC3. Неполная фиксация метанола может помешать правильной иммуномаркировке LC3, что приведет к нечетким изображениям и неоптимальному количественному определению.
Самое важное, что нужно помнить во время этой процедуры, это то, что клетки должны быть зафиксированы в холодном метаноле в течение шести минут, а не в параформальдегиде. После этой процедуры можно проанализировать колокализацию между LC3 и другими белками, что позволит изучить различные молекулярные пути, связанные с функциями LC3.
