L’immunofluorescence CL3 permet de déterminer les niveaux d’autophagie dans les cellules pancréatiques. Il permet d’étudier les effets potentiels de différents agents sur l’autophagie des cellules pancréatiques. L’immunofluorescence est une technique utilisée pour détecter la protéine LC3 endogène, qui évite les problèmes causés par la surexpression de la CL3, tels que la formation d’agrégats de protéines sans rapport avec l’autophagie.
Felipe Renna, titulaire d’un doctorat, et Malena Herrera Lopez, doctorante du laboratoire de Maria Ines Vaccaro, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer la préparation des cellules, faites tremper des couvercles ronds de 12 millimètres dans de l’éthanol absolu. Après avoir retiré le couvercle, placez le couvercle trempé verticalement dans la plaque à 24 puits.
Exposez la plaque multipuits aux rayons ultraviolets pendant 15 minutes. Positionnez ensuite le couvercle horizontalement et lavez-le avec DMEM. Maintenant, voyez le faible nombre de cellules pancréatiques, re-suspendues dans DMEM, contenant 10% FBS, pénicilline et streptomycine, et incuber les cellules pendant deux jours.
Deux jours après l’ensemencement cellulaire, préparer la solution de gemcitabine dans du DMEM à une concentration d’un microgramme par microlitre. Ensuite, aspirez la moitié du volume de chaque puits dans un tube séparé et ajoutez la quantité appropriée de solution de gemcitabine. Remettez le demi-volume correspondant à chaque puits dans les puits traités, et incuber les cellules pendant 24 heures.
Pour fixer et perméabiliser les cellules, ajoutez du méthanol froid dans une plaque de 24 puits contenant des cellules. Préparez également une assiette à six puits avec du PBS froid. À l’aide d’une aiguille de seringue et d’une pince à épiler, prenez chaque bordereau de couverture et lavez-le deux fois dans du PBS.
Incuber ensuite dans le méthanol pendant six minutes. Après avoir lavé deux fois avec du PBS, incuber les bordereaux de couverture dans une solution de blocage pendant une heure. Ajouter un anti LC3 dans la solution bloquante dans un rapport de un à 1000, et maintenir sur la glace.
Placez un morceau de film d’étanchéité de laboratoire sur le couvercle multipuits et ajoutez 25 microlitres de solution anti-LC3 par glissement de couvercle sur le film d’étanchéité. À l’aide d’une aiguille de seringue et d’une pince à épiler, placez chaque glissement de couvercle sur la goutte d’anticorps primaire, en vous assurant que le côté cellulaire est en contact avec la solution. Placez la plaque multipuits dans la chambre d’humidité.
Couvrez-le de papier d’aluminium et incuber toute la nuit au réfrigérateur. Le lendemain, retirez la plaque multipuits de la chambre d’humidité. Replacez les couvercles sur la plaque multipuits et lavez-les trois fois avec du PBS.
Diluer l’anti-lapin marqué par fluorescence dans une solution de blocage dans un rapport de un à 800, et garder sur la glace dans l’obscurité. Après avoir scellé le couvercle multipuits, ajoutez 25 microlitres de solution anti-lapin par glissement de couvercle sur le film d’étanchéité. Et traiter le capuchon avec un anticorps secondaire comme démontré précédemment.
Incuber ensuite la plaque dans la chambre d’humidité pendant deux heures à température ambiante, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation avec des anticorps, laver trois fois les bordereaux de couverture sur la plaque multipuits avec du PBS. Incuber chaque couvercle avec la solution DAPI préparée pendant 10 minutes.
Une fois lavé avec du PBS, maintenez la plaque multipuits dans l’obscurité. Pour le montage cellulaire, préparez deux béchers avec de l’eau et un morceau de papier. Ajouter 10 microlitres de solution PVA-DABCO par glissière sur une lame.
Lavez le couvercle à l’eau, puis séchez-le sur du papier. Enfin, placez-le sur la goutte PVA-DABCO. Et sécher toute la nuit dans l’obscurité.
Le lendemain, à l’aide d’un microscope confocale inversé, visualisez les cellules marquées et capturez les images. Après avoir capturé des images, faites glisser et déposez chaque fichier image contenant les chaînes capturées dans l’écran Fidji. Dans la boîte de dialogue, cliquez sur OK pour ouvrir l’image.
Fermez ensuite la fenêtre de console ouverte. Sous l’onglet Image, sélectionnez Couleur, puis Fractionner les canaux. Fermez l’image correspondant aux canaux autres que l’image LC3.
Ensuite, dans l’onglet Image, sélectionnez Ajuster, puis Balance des couleurs. Déplacez le curseur maximal vers la gauche jusqu’à saturation de l’image pour visualiser les contours de la cellule. Utilisez l’outil de sélection à main levée pour dessiner le contour de la cellule, puis cliquez sur Réinitialiser pour ajuster les couleurs.
Pour couper l’élément sélectionné dans l’onglet Modifier, sélectionnez Couper, puis fermez l’image sans l’enregistrer. Et dans l’onglet Modifier, sélectionnez Coller. Dans le menu Analyser, choisissez l’outil Compteur d’objets 3D.
Définissez le seuil à 2000 et le filtre de taille à 50 à 500. Assurez-vous que les objets et les boîtes de résumé sont marqués, et cliquez sur OK.In la fenêtre du journal, le nombre de points sera décrit comme objets détectés. L’immunofluorescence indiquait la distribution cellulaire de la protéine LC3, tandis que le DAPI montrait une localisation nucléaire dans les cellules pancréatiques.
Les points CL3 ont augmenté de manière significative sous traitement par gemcitabine, indiquant une activité autophagique. Sous une confluence excessive, les cellules exocrines du pancréas ont tendance à s’empiler et à se développer les unes sur les autres. La méthode de fixation cellulaire du paraformaldéhyde s’est avérée inefficace pour préserver les protéines CL3, car elle ne reflétait pas une distribution précise.
Lorsque la fixation ou le traitement a été effectué sans attendre deux jours après l’ensemencement, les cellules PANC1 avaient une forme ronde. Cette morphologie a diminué la relation entre le cytoplasme et le noyau, ce qui rend difficile la compréhension de la distribution intracellulaire de la CL3. Une fixation incomplète du méthanol pourrait interférer avec le marquage immunologique LC3, ce qui entraînerait des images peu claires et une quantification sous-optimale.
La chose la plus importante à retenir au cours de cette procédure est que les cellules doivent être fixées dans du méthanol froid pendant six minutes, au lieu de paraformaldéhyde. Suite à cette procédure, la colocalisation entre LC3 et d’autres protéines peut être analysée, permettant l’étude de différentes voies moléculaires liées aux fonctions LC3.
