LC3 immünofloresansı, pankreas hücrelerinde otofaji seviyelerinin belirlenmesini sağlar. Farklı ajanların pankreas hücre otofajisi üzerindeki potansiyel etkilerinin incelenmesine izin verir. İmmünofloresan, otofaji ile ilgisi olmayan protein agregaları oluşturmak gibi aşırı eksprese LC3'ün neden olduğu sorunları önleyen endojen LC3 proteinini tespit etmek için kullanılan bir tekniktir.
Prosedürü gösterecek olan doktora mezunu Felipe Renna ve Maria Ines Vaccaro'nun laboratuvarından doktora öğrencisi Malena Herrera Lopez olacak. Hücre hazırlığına başlamak için, 12 milimetrelik yuvarlak kapak kaymalarını mutlak etanol içine batırın. Kapağı çıkardıktan sonra, ıslatılmış kapak kaymasını dikey olarak 24 delikli plakaya yerleştirin.
Çok kuyucuklu plakayı 15 dakika boyunca ultraviyole radyasyona maruz bırakın. Ardından kapak kayışını yatay olarak konumlandırın ve DMEM ile yıkayın. Şimdi,% 10 FBS, penisilin ve streptomisin içeren DMEM'de yeniden askıya alınan pankreas hücrelerinin düşük pasaj sayısını görün ve hücreleri iki gün boyunca inkübe edin.
Hücre tohumlamasından iki gün sonra, DMEM'de mikrolitre konsantrasyon başına bir mikrogramda gemsitabin çözeltisi hazırlayın. Daha sonra her bir kuyucuktan hacmin yarısını ayrı bir tüpte aspire edin ve uygun miktarda gemsitabin çözeltisi ekleyin. Her bir kuyucuğa karşılık gelen yarım hacmi tedavi edilen kuyucuklara geri döndürün ve hücreleri 24 saat boyunca inkübe edin.
Hücreleri sabitlemek ve geçirgenleştirmek için, hücreleri içeren 24 delikli bir plakaya soğuk metanol ekleyin. Ayrıca soğuk PBS ile altı delikli bir plaka hazırlayın. Bir şırınga iğnesi ve cımbız kullanarak, her kapak kaymasını alın ve PBS'de iki kez yıkayın.
Sonra altı dakika boyunca metanol içinde inkübe edin. PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, kapak kaymalarını bir saat boyunca bloke edici bir çözelti içinde inkübe edin. Blokaj çözeltisine bir ila 1000 oranında bir anti LC3 ekleyin ve buz üzerinde tutun.
Çok kuyucuklu kapağın üzerine bir parça laboratuvar sızdırmazlık filmi yerleştirin ve sızdırmazlık filmi üzerine kapak kayması başına 25 mikrolitre anti-LC3 çözeltisi ekleyin. Bir şırınga iğnesi ve cımbız kullanarak, her kapak kaymasını birincil antikor damlasının üzerine yerleştirin ve hücre tarafının çözelti ile temas halinde olduğundan emin olun. Çok kuyucuklu plakayı nem odasına yerleştirin.
Folyo ile örtün ve gece boyunca buzdolabında inkübe edin. Ertesi gün, çok kuyucuklu plakayı nem odasından çıkarın. Kapak fişlerini tekrar çok kuyucuklu plakaya yerleştirin ve PBS ile üç kez yıkayın.
Floresan etiketli anti-tavşanı, bloke edici çözeltide bir ila 800 oranında seyreltin ve karanlıkta buz üzerinde tutun. Çok kuyucuklu kapağı kapattıktan sonra, sızdırmazlık filmi üzerine kapak kayması başına 25 mikrolitre tavşan önleyici çözelti ekleyin. Ve kapak kaymasını daha önce gösterildiği gibi ikincil bir antikor ile tedavi edin.
Daha sonra plakayı nem odasında, ışıktan korunan oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. Antikor ile inkübasyonun sonunda, çok kuyucuklu plaka üzerindeki kapak kaymalarını PBS ile üç kez yıkayın. Her kapak fişini hazırlanan DAPI çözeltisi ile 10 dakika boyunca inkübe edin.
PBS ile yıkandıktan sonra, çok kuyucuklu plakayı karanlıkta tutun. Hücre montajı için, su ve bir parça kağıt ile iki beher hazırlayın. Bir slayttaki kapak fişi başına 10 mikrolitre PVA-DABCO çözeltisi ekleyin.
Kapak fişini suda yıkayın ve ardından kağıt üzerinde kurutun. Son olarak, PVA-DABCO damlasının üzerine yerleştirin. Ve karanlıkta gece boyunca kurutun.
Ertesi gün, ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop kullanarak, etiketli hücreleri görselleştirin ve görüntüleri yakalayın. Görüntüleri yakaladıktan sonra, yakalanan kanalları içeren her görüntü dosyasını Fiji ekranında sürükleyip bırakın. İletişim kutusunda, görüntüyü açmak için Tamam'ı tıklatın.
Ardından açılan konsol penceresini kapatın. Görüntü sekmesinden Renk'i ve ardından Kanalları Böl'ü seçin. LC3 görüntüsü dışındaki kanallara karşılık gelen görüntüyü kapatın.
Ardından Görüntü sekmesinde Ayarla'yı ve ardından Renk Dengesi'ni seçin. Hücre hatlarını görselleştirmek için görüntü doygunluğa ulaşana kadar maksimum kaydırıcıyı sola hareket ettirin. Hücre anahattını çizmek için serbest seçim aracını kullanın ve renkleri ayarlamak için sıfırla'yı tıklatın.
Seçili öğeyi Düzen sekmesinden kesmek için Kes'i seçin ve görüntüyü kaydetmeden kapatın. Ve Düzenle sekmesinden yapıştır'ı seçin. Analiz menüsünde, 3B Nesneler Sayacı aracını seçin.
Eşiği 2000 olarak ve boyut filtresini 50 ila 500 olarak ayarlayın. Nesnelerin ve özet kutularının işaretlendiğinden emin olun ve günlük penceresinin OK.In tıklayın, nokta sayısı algılanan nesneler olarak tanımlanacaktır. İmmünofloresan, LC3 proteininin hücresel dağılımını gösterirken, DAPI pankreas hücrelerinde nükleer lokalizasyon gösterdi.
LC3 noktaları, gemsitabin tedavisi altında otofajik aktiviteyi gösteren önemli ölçüde artmıştır. Aşırı bir birleşme altında, ekzokrin pankreas hücreleri yığılma ve birbirlerinin üzerine yığma eğilimindedir. Paraformaldehit hücre fiksasyon yöntemi, LC3 proteinlerini korumak için etkisizdi, çünkü doğru dağılımı yansıtmıyordu.
Fiksasyon veya tedavi, tohumlamadan iki gün sonra beklemeden yapıldığında, PANC1 hücreleri yuvarlak bir şekle sahipti. Bu morfoloji, sitoplazma ve çekirdek arasındaki ilişkiyi azaltarak LC3'ün hücre içi dağılımını anlamayı zorlaştırdı. Tamamlanmamış metanol fiksasyonu, uygun LC3 immün etiketlemesine müdahale ederek net olmayan görüntülere ve yetersiz nicelemeye neden olabilir.
Bu prosedür sırasında hatırlanması gereken en önemli şey, hücrelerin paraformaldehit yerine altı dakika boyunca soğuk metanol içinde sabitlenmesi gerektiğidir. Bu prosedürü takiben, LC3 ve diğer proteinler arasındaki kolokalizasyon analiz edilebilir ve LC3 fonksiyonlarıyla ilgili farklı moleküler yolakların incelenmesine izin verilir.
