LC3 면역형광을 사용하면 췌장 세포의 자가포식 수준을 측정할 수 있습니다. 그것은 췌장 세포 자가포식에 대한 다양한 약제의 잠재적 효과에 대한 연구를 허용합니다. 면역형광법은 내인성 LC3 단백질을 검출하는 데 사용되는 기술로, 자가포식과 관련이 없는 단백질 응집체 형성과 같은 LC3 과발현으로 인한 문제를 방지합니다.
이 절차를 시연하는 것은 박사 학위 졸업생 인 펠리페 레나 (Felipe Renna)와 마리아 이네스 바카로 (Maria Ines Vaccaro) 연구소의 박사 과정 학생 인 말레나 에레라 로페즈 (Malena Herrera Lopez)가 될 것입니다. 세포 준비를 시작하려면 12mm 원형 커버 슬립을 무수 에탄올에 담그십시오. 덮개를 제거한 후 담근 덮개 슬립을 24웰 플레이트에 수직으로 놓습니다.
멀티웰 플레이트를 자외선에 15분 동안 노출시킨다. 그런 다음 커버 슬립을 수평으로 놓고 DMEM으로 세척합니다. 이제 췌장 세포의 낮은 계대 수를 확인하고, 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유한 DMEM에 재현탁하고, 세포를 이틀 동안 배양한다.
세포 파종 2일 후, DMEM에서 젬시타빈 용액을 마이크로리터당 1마이크로그램 농도로 준비한다. 그런 다음 별도의 튜브에서 각 웰의 부피 절반을 흡인하고 적절한 양의 젬시 타빈 용액을 첨가하십시오. 각 웰에 상응하는 절반 부피를 처리된 웰로 되돌리고, 세포를 24시간 동안 인큐베이션한다.
세포를 고정하고 투과시키기 위해, 차가운 메탄올을 세포를 함유하는 24-웰 플레이트에 첨가한다. 또한 차가운 PBS로 6 웰 플레이트를 준비하십시오. 주사기 바늘과 핀셋을 사용하여 각 커버 슬립을 꺼내 PBS로 두 번 씻습니다.
그런 다음 메탄올에서 6 분 동안 배양합니다. PBS로 2회 세척한 후, 커버슬립을 블로킹 용액에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 블로킹 용액에 안티 LC3를 1:1000의 비율로 첨가하고 얼음 위에서 유지한다.
멀티웰 뚜껑 위에 실험실 밀봉 필름 조각을 놓고 밀봉 필름 위에 커버 슬립당 25마이크로리터의 anti-LC3 용액을 추가합니다. 주사기 바늘과 핀셋을 사용하여 각 커버 슬립을 1차 항체 방울 위에 놓고 세포 쪽이 용액과 접촉하도록 합니다. 멀티웰 플레이트를 습도 챔버에 놓습니다.
호일로 덮고 냉장고에서 밤새 부화시킵니다. 다음날, 습도 챔버로부터 멀티웰 플레이트를 제거한다. 커버 슬립을 멀티웰 플레이트에 다시 놓고 PBS로 세 번 세척합니다.
형광 표지 된 anti-rabbit을 차단 용액에 1 : 800의 비율로 희석하고 어둠 속에서 얼음 위에 보관하십시오. 멀티 웰 뚜껑을 밀봉 한 후 밀봉 필름 위에 커버 슬립 당 25 마이크로 리터의 토끼 방지 용액을 추가합니다. 그리고 이전에 입증된 바와 같이 커버 슬립을 2차 항체로 처리한다.
그런 다음 빛으로부터 보호 된 실온에서 2 시간 동안 습도 챔버에서 플레이트를 배양하십시오. 항체와 함께 배양이 끝나면 PBS로 멀티웰 플레이트 상의 커버 슬립을 3회 세척합니다. 준비된 DAPI 용액으로 각 커버 슬립을 10분 동안 배양합니다.
PBS로 세척한 후, 멀티웰 플레이트를 어둠 속에서 유지한다. 세포 몽타주를 위해 물과 종이 한 장으로 두 개의 비커를 준비하십시오. 슬라이드의 커버 슬립당 10마이크로리터의 PVA-DABCO 용액을 추가합니다.
커버 슬립을 물로 씻은 다음 종이로 말리십시오. 마지막으로 PVA-DABCO 드롭 위에 놓습니다. 그리고 어둠 속에서 밤새 말리십시오.
다음 날, 도립 컨포칼 현미경을 사용하여 라벨링된 세포를 시각화하고 이미지를 캡처합니다. 이미지를 캡처한 후 캡처된 채널이 포함된 각 이미지 파일을 피지 화면으로 끌어다 놓습니다. 대화 상자에서 확인을 클릭하여 이미지를 엽니다.
그런 다음 열려 있는 콘솔 창을 닫습니다. Image(이미지) 탭에서 Color(색상)를 선택한 다음 Split Channels(채널 분할)를 선택합니다. LC3 이미지 이외의 채널에 해당하는 이미지를 닫습니다.
그런 다음 Image(이미지) 탭에서 Adjust(조정)를 선택한 다음 Color Balance(색상 균형)를 선택합니다. 이미지가 포화될 때까지 최대 슬라이더를 왼쪽으로 이동하여 셀 윤곽을 시각화합니다. 자유형 선택 도구를 사용하여 셀 윤곽선을 그리고 [재설정]을 클릭하여 색상을 조정합니다.
편집 탭에서 선택한 항목을 잘라내려면 잘라내기를 선택하고 이미지를 저장하지 않고 닫습니다. 그리고 편집 탭에서 붙여넣기를 선택합니다. 분석 메뉴에서 3D 개체 카운터 도구를 선택합니다.
임계값을 2000으로 설정하고 크기 필터를 50에서 500으로 설정합니다. 개체 및 요약 상자가 표시되어 있는지 확인하고 로그 창 OK.In 클릭하면 개체 수가 감지된 개체로 설명됩니다. 면역형광은 LC3 단백질의 세포 분포를 나타내는 반면, DAPI는 췌장 세포에서 핵 국소화를 나타냈다.
LC3 도트는 젬시타빈 처리 하에서 유의하게 증가하여 자가포식 활성을 나타냅니다. 과도한 합류 하에서, 외분비 췌장 세포는 쌓여서 서로 위로 자라는 경향이 있습니다. 파라포름알데히드 세포 고정 방법은 정확한 분포를 반영하지 않았기 때문에 LC3 단백질을 보존하는 데 효과적이지 않았습니다.
파종 후 이틀을 기다리지 않고 고정 또는 처리를 수행하였을 때, PANC1 세포는 둥근 모양을 가졌다. 이 형태는 세포질과 핵 사이의 관계를 감소시켜 LC3의 세포 내 분포를 이해하기 어렵게 만듭니다. 불완전한 메탄올 고정은 적절한 LC3 면역 표지를 방해하여 이미지가 불분명하고 정량화가 최적화되지 않을 수 있습니다.
이 과정에서 기억해야 할 가장 중요한 점은 파라 포름 알데히드 대신 차가운 메탄올에 6 분 동안 세포를 고정해야한다는 것입니다. 이 절차에 따라 LC3와 다른 단백질 간의 공동 국소화를 분석하여 LC3 기능과 관련된 다양한 분자 경로를 연구할 수 있습니다.
