A imunofluorescência da CL3 permite a determinação dos níveis de autofagia nas células pancreáticas. Permite o estudo dos potenciais efeitos de diferentes agentes sobre a autofagia das células pancreáticas. A imunofluorescência é uma técnica utilizada para detectar a proteína LC3 endógena, que evita problemas causados pela superexpressão da CL3, como a formação de agregados proteicos não relacionados à autofagia.
Quem demonstrará o procedimento serão Felipe Renna, doutorando, e Malena Herrera Lopez, doutoranda do laboratório de Maria Inês Vaccaro. Para iniciar a preparação celular, mergulhe a tampa redonda de 12 milímetros em etanol absoluto. Depois de remover a tampa, coloque a tampa embebida verticalmente na placa de 24 poços.
Expor a placa multipoço à radiação ultravioleta por 15 minutos. Em seguida, posicione a tampa na horizontal e lave-a com DMEM. Agora veja o baixo número de passagem de células pancreáticas, ressuspensas em DMEM, contendo 10% FBS, penicilina e estreptomicina, e incube as células por dois dias.
Dois dias após a semeadura celular, preparar solução de gemcitabina em DMEM na concentração de um micrograma por microlitro. Em seguida, aspirar metade do volume de cada poço em um tubo separado e adicionar a quantidade adequada de solução de gemcitabina. Devolver o meio volume correspondente a cada poço de volta aos poços tratados e incubar as células por 24 horas.
Para fixar e permeabilizar as células, adicione metanol frio em uma placa de 24 poços contendo células. Prepare também um prato de seis poços com PBS frio. Usando uma agulha de seringa e uma pinça, pegue cada tampa e lave-a duas vezes em PBS.
Em seguida, incube em metanol por seis minutos. Depois de lavar duas vezes com PBS, incube as lamínulas de tampa em uma solução de bloqueio por uma hora. Adicione um anti LC3 na solução de bloqueio na proporção de um para 1000 e mantenha no gelo.
Coloque um pedaço de filme de vedação de laboratório sobre a tampa de vários poços e adicione 25 microlitros de solução anti-LC3 por deslizamento de tampa sobre a película de vedação. Usando uma agulha de seringa e uma pinça, coloque cada tampa deslizante sobre a gota primária de anticorpos, garantindo que o lado celular esteja em contato com a solução. Coloque a placa de vários poços na câmara de umidade.
Cubra com papel alumínio e incube durante a noite na geladeira. No dia seguinte, remova a placa de poço múltiplo da câmara de umidade. Coloque as tampas de volta na placa de vários poços e lave-as com PBS três vezes.
Diluir o anticoelho fluorescente marcado em solução de bloqueio na proporção de um para 800 e manter o gelo no escuro. Depois de selar a tampa de vários poços, adicione 25 microlitros de solução anti-coelho por deslizamento da tampa sobre a película de vedação. E tratar a tampa com um anticorpo secundário, como demonstrado anteriormente.
Em seguida, incube a placa na câmara de umidade por duas horas à temperatura ambiente, protegida da luz. Ao final da incubação com anticorpo, lave as lamínulas da tampa na placa de poço múltiplo com PBS três vezes. Incubar cada lamínula de cobertura com a solução DAPI preparada durante 10 minutos.
Depois de lavada com PBS, mantenha a placa de poço múltiplo no escuro. Para a montagem celular, prepare dois copos com água e um pedaço de papel. Adicione 10 microlitros de solução de PVA-DABCO por lamínula em uma lâmina.
Lave a tampa em água e depois seque em papel. Por fim, coloque-o sobre a gota PVA-DABCO. E secar durante a noite no escuro.
No dia seguinte, utilizando microscópio confocal invertido, visualize as células marcadas e capture as imagens. Depois de capturar imagens, arraste e solte cada arquivo de imagem contendo os canais capturados na tela de Fiji. Na caixa de diálogo, clique em OK para abrir a imagem.
Em seguida, feche a janela do console aberta. Na guia Imagem, selecione Cor e Canais Divididos. Feche a imagem correspondente aos canais diferentes da imagem LC3.
Em seguida, na guia Imagem, selecione Ajustar, seguido de Equilíbrio de Cores. Mova o controle deslizante máximo para a esquerda até que a imagem satura para visualizar os contornos da célula. Use a ferramenta de seleção à mão livre para desenhar o contorno da célula e clique em redefinir para ajustar as cores.
Para cortar o item selecionado na guia Editar, selecione Recortar e feche a imagem sem salvá-la. E na guia Editar, selecione colar. No menu Analisar, escolha a ferramenta Contador de objetos 3D.
Defina o limite em 2000 e o filtro de tamanho em 50 a 500. Verifique se os objetos e as caixas de resumo estão marcados e clique em OK.In janela de log, o número de pontos será descrito como objetos detectados. A imunofluorescência indicou a distribuição celular da proteína LC3, enquanto o DAPI mostrou localização nuclear nas células pancreáticas.
Os pontos da CL3 aumentaram significativamente sob o tratamento com gencitabina, indicando atividade autofágica. Sob uma confluência excessiva, as células exócrinas do pâncreas tendem a se acumular e crescer umas sobre as outras. O método de fixação celular com paraformaldeído foi ineficaz para preservar as proteínas LC3, pois não refletiu distribuição precisa.
Quando a fixação ou o tratamento foram realizados sem esperar dois dias após a semeadura, as células PANC1 apresentaram forma arredondada. Essa morfologia diminuiu a relação entre o citoplasma e o núcleo, dificultando o entendimento da distribuição intracelular da CL3. A fixação incompleta de metanol pode interferir na marcação imunológica adequada da LC3, levando a imagens pouco claras e quantificação subótima.
A coisa mais importante a lembrar durante este procedimento é que as células devem ser fixadas em metanol frio por seis minutos, em vez de paraformaldeído. Após este procedimento, a colocalização entre a LC3 e outras proteínas pode ser analisada, permitindo o estudo de diferentes vias moleculares relacionadas às funções da LC3.
