L'immunofluorescenza LC3 consente la determinazione dei livelli di autofagia nelle cellule pancreatiche. Permette lo studio dei potenziali effetti di diversi agenti sull'autofagia delle cellule pancreatiche. L'immunofluorescenza è una tecnica utilizzata per rilevare la proteina LC3 endogena, che evita problemi causati dalla sovraespressione di LC3, come la formazione di aggregati proteici non correlati all'autofagia.
A dimostrare la procedura saranno Felipe Renna, dottorando, e Malena Herrera Lopez, dottoranda del laboratorio di Maria Ines Vaccaro. Per iniziare la preparazione delle cellule, immergere i vetrini di copertura rotondi da 12 millimetri in etanolo assoluto. Dopo aver rimosso il coperchio, posizionare verticalmente la linguetta del coperchio imbevuto nella piastra a 24 pozzetti.
Esporre la piastra multipozzetto alle radiazioni ultraviolette per 15 minuti. Quindi posizionare il vetrino del coperchio orizzontalmente e lavarlo con DMEM. Ora vedi il basso numero di cellule pancreatiche, ri-sospese in DMEM, contenenti il 10% di FBS, penicillina e streptomicina, e incubare le cellule per due giorni.
Due giorni dopo la semina cellulare, preparare la soluzione di gemcitabina in DMEM a una concentrazione di microgrammi per microlitro. Quindi aspirare metà del volume da ciascun pozzetto in un tubo separato e aggiungere la quantità appropriata di soluzione di gemcitabina. Riportare il mezzo volume corrispondente a ciascun pozzetto nei pozzetti trattati e incubare le cellule per 24 ore.
Per fissare e permeabilizzare le cellule, aggiungere metanolo freddo in una piastra contenente celle a 24 pozzetti. Preparare anche una piastra a sei pozzetti con PBS freddo. Utilizzando un ago da siringa e una pinzetta, prendere ogni foglietto di copertura e lavarlo due volte in PBS.
Quindi incubare in metanolo per sei minuti. Dopo aver lavato due volte con PBS, incubare i vetrini di copertura in una soluzione bloccante per un'ora. Aggiungere un anti LC3 nella soluzione di blocco in un rapporto di uno a 1000 e mantenere sul ghiaccio.
Posizionare un pezzo di pellicola sigillante da laboratorio sul coperchio multipozzetto e aggiungere 25 microlitri di soluzione anti-LC3 per vetrino di copertura sulla pellicola sigillante. Utilizzando un ago da siringa e una pinzetta, posizionare ogni vetrino di copertura sulla goccia dell'anticorpo primario, assicurandosi che il lato cellulare sia in contatto con la soluzione. Posizionare la piastra multipozzetto nella camera di umidità.
Coprirlo con un foglio di alluminio e incubare per una notte in frigorifero. Il giorno successivo, rimuovere la piastra multi-pozzetto dalla camera di umidità. Posizionare i foglietti di copertura sulla piastra multipozzetto e lavarli con PBS tre volte.
Diluire l'anti-coniglio marcato con fluorescenza in soluzione bloccante in un rapporto di uno a 800 e mantenere sul ghiaccio al buio. Dopo aver sigillato il coperchio multi-pozzetto, aggiungere 25 microlitri di soluzione anti-coniglio per scivolone di copertura sul film sigillante. E trattare il vetrino di copertura con un anticorpo secondario come precedentemente dimostrato.
Quindi incubare la piastra nella camera di umidità per due ore a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Alla fine dell'incubazione con anticorpo, lavare tre volte i vetrini di copertura sulla piastra multipozzetto con PBS. Incubare ogni vetrino di copertura con la soluzione DAPI preparata per 10 minuti.
Una volta lavato con PBS, mantenere la piastra multi-pozzetto al buio. Per il montaggio cellulare, preparare due bicchieri con acqua e un pezzo di carta. Aggiungere 10 microlitri di soluzione PVA-DABCO per vetrino di copertina.
Lavare il coperchio in acqua, quindi asciugarlo su carta. Infine, posizionalo sopra la goccia PVA-DABCO. E asciugare durante la notte al buio.
Il giorno successivo, utilizzando un microscopio confocale invertito, visualizzare le cellule etichettate e catturare le immagini. Dopo aver acquisito le immagini, trascina e rilascia ogni file immagine contenente i canali acquisiti nella schermata Fiji. Nella finestra di dialogo, fate clic su OK per aprire l'immagine.
Quindi chiudere la finestra della console aperta. Nella scheda Immagine selezionare Colore, quindi Dividi canali. Chiudere l'immagine corrispondente ai canali diversi dall'immagine LC3.
Quindi, nella scheda Immagine, seleziona Regola, quindi Bilanciamento colore. Spostare il dispositivo di scorrimento massimo verso sinistra fino a saturare l'immagine per visualizzare i contorni delle celle. Usate lo strumento selezione a mano libera per disegnare il contorno della cella e fate clic su Reimposta per regolare i colori.
Per tagliare l'elemento selezionato dalla scheda Modifica, selezionare Taglia e chiudere l'immagine senza salvarla. E dalla scheda Modifica, seleziona incolla. Nel menu Analizza, scegliete lo strumento Contatore oggetti 3D.
Impostare la soglia su 2000 e il filtro delle dimensioni su 50-500. Assicurarsi che gli oggetti e le caselle di riepilogo siano contrassegnati e fare clic su OK.In finestra del registro, il numero di punti verrà descritto come oggetti rilevati. L'immunofluorescenza ha indicato la distribuzione cellulare della proteina LC3, mentre il DAPI ha mostrato la localizzazione nucleare nelle cellule pancreatiche.
I punti LC3 sono aumentati significativamente durante il trattamento con gemcitabina, indicando attività autofagica. Sotto un'eccessiva confluenza, le cellule del pancreas esocrino tendono ad accumularsi e crescere l'una sopra l'altra. Il metodo di fissazione delle cellule paraformaldeide era inefficace per preservare le proteine LC3, in quanto non rifletteva una distribuzione accurata.
Quando la fissazione o il trattamento sono stati eseguiti senza attendere due giorni dopo la semina, le cellule PANC1 avevano una forma rotonda. Questa morfologia ha diminuito la relazione tra il citoplasma e il nucleo, rendendo difficile comprendere la distribuzione intracellulare di LC3. La fissazione incompleta del metanolo potrebbe interferire con la corretta etichettatura immunologica della CL3, portando a immagini poco chiare e a una quantificazione non ottimale.
La cosa più importante da ricordare durante questa procedura è che le cellule devono essere fissate in metanolo freddo per sei minuti, invece di paraformaldeide. Seguendo questa procedura, può essere analizzata la colocalizzazione tra LC3 e altre proteine, permettendo lo studio di diversi pathways molecolari correlati alle funzioni di LC3.
