Die LC3-Immunfluoreszenz ermöglicht die Bestimmung des Autophagieniveaus in Pankreaszellen. Es ermöglicht die Untersuchung der möglichen Auswirkungen verschiedener Wirkstoffe auf die Autophagie von Bauchspeicheldrüsenzellen. Immunfluoreszenz ist eine Technik zum Nachweis von endogenem LC3-Protein, wodurch Probleme vermieden werden, die durch eine Überexpression von LC3 verursacht werden, wie z. B. die Bildung von Proteinaggregaten, die nichts mit Autophagie zu tun haben.
Felipe Renna, Doktorand, und Malena Herrera López, Doktorandin aus dem Labor von Maria Ines Vaccaro, demonstrieren das Verfahren. Um mit der Zellvorbereitung zu beginnen, tränken Sie runde 12-Millimeter-Deckgläser in absolutem Ethanol. Legen Sie nach dem Entfernen des Deckels das getränkte Deckglas senkrecht in die 24-Well-Platte.
Setzen Sie die Multi-Well-Platte 15 Minuten lang ultravioletter Strahlung aus. Positionieren Sie dann das Deckglas waagerecht und waschen Sie es mit DMEM. Sehen Sie sich nun die geringe Anzahl von Pankreaszellen an, die in DMEM resuspendiert wurden und 10 % FBS, Penicillin und Streptomycin enthalten, und inkubieren Sie die Zellen zwei Tage lang.
Zwei Tage nach der Zellaussaat wird eine Gemcitabinlösung in DMEM mit einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter hergestellt. Saugen Sie dann die Hälfte des Volumens aus jeder Vertiefung in einem separaten Röhrchen ab und fügen Sie eine angemessene Menge Gemcitabinlösung hinzu. Geben Sie das halbe Volumen, das jeder Vertiefung entspricht, zurück in die behandelten Vertiefungen und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang.
Zur Fixierung und Permeabilisierung der Zellen wird kaltes Methanol in eine 24-Well-Platte mit Zellen gegeben. Bereiten Sie auch eine Sechs-Well-Platte mit kaltem PBS vor. Nehmen Sie mit einer Spritzennadel und einer Pinzette jedes Deckglas und waschen Sie es zweimal in PBS.
Anschließend sechs Minuten in Methanol inkubieren. Nach zweimaligem Waschen mit PBS inkubieren Sie die Deckgläser eine Stunde lang in einer Blockierlösung. Fügen Sie der Blockierlösung im Verhältnis eins zu 1000 ein Anti-LC3 hinzu und halten Sie es auf Eis.
Legen Sie ein Stück Laborversiegelungsfolie über den Multi-Well-Deckel und geben Sie 25 Mikroliter Anti-LC3-Lösung pro Deckglas über die Versiegelungsfolie. Legen Sie mit einer Spritzennadel und einer Pinzette jedes Deckglas über den primären Antikörpertropfen und stellen Sie sicher, dass die Zellseite mit der Lösung in Kontakt kommt. Legen Sie die Multi-Well-Platte in die Feuchtigkeitskammer.
Mit Folie abdecken und über Nacht im Kühlschrank inkubieren. Nehmen Sie am nächsten Tag die Multi-Well-Platte aus der Feuchtigkeitskammer. Legen Sie die Deckgläser wieder auf die Multi-Well-Platte und waschen Sie sie dreimal mit PBS.
Verdünnen Sie fluoreszenzmarkiertes Anti-Kaninchen in einer Blockierlösung im Verhältnis eins zu 800 und bewahren Sie es im Dunkeln auf Eis auf. Geben Sie nach dem Verschließen des Multiwell-Deckels 25 Mikroliter Anti-Kaninchen-Lösung pro Deckglas über die Siegelfolie. Und behandeln Sie das Deckglas wie zuvor gezeigt mit einem Sekundärantikörper.
Anschließend inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang in der Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur und geschützt vor Licht. Waschen Sie am Ende der Inkubation mit Antikörpern die Deckgläser auf der Multiwell-Platte dreimal mit PBS. Inkubieren Sie jedes Deckglas mit der vorbereiteten DAPI-Lösung 10 Minuten lang.
Bewahren Sie die Multiwell-Platte nach dem Waschen mit PBS im Dunkeln auf. Bereiten Sie für die Zellmontage zwei Becher mit Wasser und einem Blatt Papier vor. Geben Sie 10 Mikroliter PVA-DABCO-Lösung pro Deckglas auf einen Objektträger.
Waschen Sie das Deckglas in Wasser und trocknen Sie es dann auf Papier. Zum Schluss legen Sie es über den PVA-DABCO-Tropfen. Und trocknen Sie über Nacht im Dunkeln.
Schließen Sie dann das geöffnete Konsolenfenster. Wählen Sie auf der Registerkarte Bild die Option Farbe und dann Kanäle teilen aus. Schließen Sie das Bild, das den anderen Kanälen als dem LC3-Bild entspricht.
Wählen Sie dann auf der Registerkarte "Bild" die Option "Anpassen" und dann "Farbbalance". Verschieben Sie den Schieberegler "Maximum" nach links, bis das Bild gesättigt ist, um die Zellenkonturen zu visualisieren. Verwenden Sie das Freihandauswahlwerkzeug, um den Zellenumriss zu zeichnen, und klicken Sie auf Zurücksetzen, um die Farben anzupassen.
Um das ausgewählte Element auf der Registerkarte "Bearbeiten" auszuschneiden, wählen Sie "Ausschneiden" und schließen Sie das Bild, ohne es zu speichern. Wählen Sie auf der Registerkarte Bearbeiten die Option Einfügen aus. Wählen Sie im Menü "Analysieren" das Werkzeug "Zähler für 3D-Objekte" aus.
Legen Sie den Schwellenwert auf 2000 und den Größenfilter auf 50 bis 500 fest. Stellen Sie sicher, dass die Objekte und Zusammenfassungsfelder markiert sind, und klicken Sie auf OK.In Protokollfenster, die Anzahl der Punkte wird als erkannte Objekte beschrieben. Die Immunfluoreszenz zeigte die zelluläre Verteilung des LC3-Proteins, während die DAPI eine nukleäre Lokalisation in Pankreaszellen zeigte.
Die LC3-Punkte stiegen unter Gemcitabin-Behandlung signifikant an, was auf eine autophagische Aktivität hinweist. Bei einem übermäßigen Zusammenfluss neigen die exokrinen Pankreaszellen dazu, sich aufzutürmen und übereinander zu wachsen. Die Paraformaldehyd-Zellfixierungsmethode erwies sich als unwirksam für die Konservierung von LC3-Proteinen, da sie keine genaue Verteilung widerspiegelte.
Wenn die Fixierung oder Behandlung durchgeführt wurde, ohne zwei Tage nach der Aussaat zu warten, hatten die PANC1-Zellen eine runde Form. Diese Morphologie verringerte die Beziehung zwischen dem Zytoplasma und dem Zellkern, was es schwierig machte, die intrazelluläre Verteilung von LC3 zu verstehen. Eine unvollständige Methanolfixierung könnte die korrekte LC3-Immunmarkierung beeinträchtigen, was zu unklaren Bildern und einer suboptimalen Quantifizierung führen könnte.
Das Wichtigste, was bei diesem Verfahren zu beachten ist, ist, dass die Zellen sechs Minuten lang in kaltem Methanol anstelle von Paraformaldehyd fixiert werden müssen. Nach diesem Verfahren kann die Kolokalisation zwischen LC3 und anderen Proteinen analysiert werden, was die Untersuchung verschiedener molekularer Signalwege im Zusammenhang mit LC3-Funktionen ermöglicht.
