LC3免疫蛍光法は、膵臓細胞のオートファジーレベルの測定を可能にします。これにより、膵臓細胞のオートファジーに対するさまざまな薬剤の潜在的な影響の研究が可能になります。免疫蛍光法は、内因性LC3タンパク質を検出するために利用される技術であり、オートファジーとは無関係のタンパク質凝集体の形成など、LC3の過剰発現によって引き起こされる問題を回避します。
手順を実演するのは、博士課程の卒業生であるフェリペ・レナと、マリア・イネス・ヴァッカロの研究室の博士課程の学生であるマレーナ・エレーラ・ロペスです。細胞調製を開始するには、12ミリメートルの丸いカバースリップを無水エタノールに浸します。カバーを取り外した後、浸したカバースリップを24ウェルプレートに垂直に置きます。
マルチウェルプレートを紫外線に15分間さらします。次に、カバースリップを水平に配置し、DMEMで洗浄します。次に、10%FBS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むDMEMに再懸濁した膵臓細胞の通過数が少ないことを確認し、細胞を2日間インキュベートします。
細胞播種の2日後、DMEM中のゲムシタビン溶液を1マイクロリットル当たり1マイクログラムの濃度で調製する。次に、各ウェルから容量の半分を別々のチューブに吸引し、適量のゲムシタビン溶液を追加します。各ウェルに対応する半量を処理ウェルに戻し、細胞を24時間インキュベートする。
細胞を固定および透過処理するには、細胞を含む24ウェルプレートに冷メタノールを加えます。また、コールドPBSを含む6ウェルプレートを準備します。シリンジニードルとピンセットを使用して、各カバースリップを取り、PBSで2回洗浄します。
その後、メタノール中で6分間インキュベートします。PBSで2回洗浄した後、カバースリップをブロッキング溶液中で1時間インキュベートします。ブロッキング溶液にアンチLC3を1対1000の比率で加え、氷上で維持します。
マルチウェルの蓋の上に実験室用シーリングフィルムを置き、シーリングフィルムの上にカバースリップごとに25マイクロリットルの抗LC3溶液を追加します。シリンジニードルとピンセットを使用して、各カバースリップを一次抗体ドロップの上に置き、細胞側が溶液に接触していることを確認します。マルチウェルプレートを湿度チャンバーに入れます。
それをホイルで覆い、冷蔵庫で一晩インキュベートする。翌日、マルチウェルプレートを湿度チャンバーから取り出します。カバースリップをマルチウェルプレートに戻し、PBSで3回洗浄します。
蛍光標識した抗ウサギをブロッキング溶液で1対800の比率で希釈し、暗所で氷上に保ちます。マルチウェル蓋を密封した後、シーリングフィルムの上にカバースリップごとに25マイクロリットルの抗ウサギ溶液を追加します。そして、以前に実証されたように、カバースリップを二次抗体で処理します。
次に、プレートを湿度チャンバー内で、光から保護された室温で2時間インキュベートします。抗体とのインキュベーションが終了したら、マルチウェルプレート上のカバースリップをPBSで3回洗浄します。各カバースリップを調製したDAPI溶液で10分間インキュベートします。
PBSで洗浄したら、マルチウェルプレートを暗所に維持します。セルモンタージュのために、水と一枚の紙で2つのビーカーを準備します。スライドのカバースリップごとに10マイクロリットルのPVA-DABCO溶液を追加します。
カバースリップを水で洗い、紙で乾かします。最後に、PVA-DABCOドロップの上に置きます。そして暗闇の中で一晩乾かします。
翌日、倒立共焦点顕微鏡を使用して、標識された細胞を視覚化し、画像をキャプチャします。画像をキャプチャした後、キャプチャしたチャネルを含む各画像ファイルをフィジー画面にドラッグアンドドロップします。ダイアログ ボックスで、[OK] をクリックして画像を開きます。
次に、開いたコンソールウィンドウを閉じます。[画像] タブで、[色]、[チャンネルの分割] の順に選択します。LC3画像以外のチャンネルに対応する画像を閉じます。
次に、[画像]タブで、[調整]、[カラーバランス]の順に選択します。画像が飽和するまで最大スライダーを左に動かして、セルの輪郭を視覚化します。フリーハンド選択ツールを使用してセルの輪郭を描画し、[リセット]をクリックして色を調整します。
[編集] タブから選択した項目を切り取るには、[切り取り] を選択し、画像を保存せずに閉じます。そして、[編集]タブから[貼り付け]を選択します。[分析]メニューで、ツール[3Dオブジェクトカウンター]を選択します。
しきい値を 2000 に設定し、サイズ フィルターを 50 から 500 に設定します。オブジェクトと概要ボックスがマークされていることを確認し、ログウィンドウ OK.In をクリックすると、ドットの数が検出されたオブジェクトとして説明されます。免疫蛍光はLC3タンパク質の細胞分布を示し、DAPIは膵臓細胞に核局在を示した。
LC3ドットはゲムシタビン処理下で有意に増加し、オートファジー活性を示した。過度のコンフルエントの下では、外分泌膵臓細胞は積み重なって互いの上に成長する傾向があります。パラホルムアルデヒド細胞固定法は正確な分布を反映していないため、LC3タンパク質の保存には効果がありませんでした。
播種後2日を待たずに固定または処理を行ったところ、PANC1細胞は丸い形状を呈した。この形態は細胞質と核の関係を減少させ、LC3の細胞内分布の理解を困難にしました。メタノールの固定が不完全な場合、LC3の適切な免疫標識が妨げられ、画像が不鮮明になり、定量が最適ではなくなる可能性があります。
この手順で覚えておくべき最も重要なことは、細胞をパラホルムアルデヒドの代わりに冷たいメタノールに6分間固定する必要があるということです。この手順に続いて、LC3と他のタンパク質との間の共局在を解析することができ、LC3機能に関連するさまざまな分子経路の研究が可能になります。
