В этом протоколе подробно описан метод ультраструктурно-экспансионной микроскопии на трех стадиях жизненного цикла in vitro Trypanosoma cruzi, патогена, ответственного за болезнь Шагаса. Этот протокол предлагает альтернативу существующим методам визуализации и электронной микроскопии со сверхвысоким разрешением, преимущество которой заключается в совместимости с обычными микроскопами, которые можно найти в большинстве биологических лабораторий и на основных машинах. Он использует общие методы для большинства исследовательских лабораторий для получения изображений, которые позволяют проводить трехмерную реконструкцию.
Протокол облегчает изучение наноразмерных структур в трипаносоматидах, позволяя исследовать популяцию клеток и визуализировать весь объем интересующей клетки с высоким разрешением. Он особенно полезен для научно специфичных типов клеток в переходных фазах клеточного цикла и дифференцировки. Чтобы получить еще большее разрешение, мы будем использовать комбинацию ExM с микроскопическими методами сверхвысокого разрешения, чтобы достичь разрешения ниже 20 нанометров.
Начните с приготовления эпимастиготной суспензии Trypanosoma cruzi из культуры логарифмической фазы в среде LIT с добавлением 10% FCS. Центрифугируйте суспензию при 5 000 G в течение 10 минут при комнатной температуре. Промойте гранулу два раза с PBS, затем повторно суспендируйте в 200 микролитрах PBS.
Приклейте суспензию к круглой 12-миллиметровой крышке, покрытой поли-D-лизином, и инкубируйте ее при комнатной температуре в течение 15-20 минут до предотвращения сшивания. Соберите надосадочную жидкость монослоя клеток Vero, зараженного трипомастиготами, через четыре дня после заражения. С помощью камеры для подсчета клеток Нейбауэра определите концентрацию трипомастигот.
Центрифугируйте клеточную суспензию при 7 000 G в течение 10 минут при комнатной температуре. После промывки и ресуспензии клеток в PBS перенесите клеточную суспензию на покрытое лизином покровное стекло и инкубируйте покровное стекло при комнатной температуре в течение 10–15 минут до предотвращения сшивки. Чтобы получить амастиготы из инфицированных клеток Vero, уложите на дно 24-луночного планшета для культивирования тканей стерильный круглый покровный лист толщиной 12 миллиметров.
Далее приготовьте суспензию клеток Vero в DMEM с добавлением 2%-ной FCS, и засейте по 500 микролитров суспензии в каждую лунку. Инкубируйте планшет на ночь, чтобы обеспечить прикрепление клеток. Затем дважды промойте клетки 500 микролитрами стерильного PBS.
Добавьте трипомастиготы T.cruzi в клетки и инкубируйте в течение шести часов, как и раньше. Начните с добавления 0,5 миллилитров раствора для предотвращения сшивки в каждую лунку 24-луночного планшета. Затем погрузите 12-миллиметровую покровную горку, покрытую поли-D-лизином, с прилипшими паразитами.
После заполнения пустых лунок водой для уменьшения испарения уплотните пластину герметизирующей пленкой и инкубируйте. Чтобы зажелить образцы, сначала соберите влажную камеру в чашке Петри, поместив поверх папиросной бумаги герметизирующую пленку. Затем смочите папиросную бумагу водой и выдерживайте при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение 20 минут, чтобы охладить ее.
Положите прохладную влажную камеру на лед. Далее, с помощью трехмиллилитровой пастеровской пипетки, аспирируйте раствор для предотвращения сшивания из лунок 24-луночной пластины. Теперь с помощью пинцета удалите покровные листки и положите их на папиросную бумагу паразитами вверх.
Возьмите в пробирку 90 микролитров мономерного раствора и добавьте по пять микролитров размороженных ТЕМЕД и АФС. Встряхните смесь в течение двух-трех секунд. Нанесите пипеткой 35 микролитров этой смеси на герметизирующую пленку для каждого покровного стекла, и сразу же с помощью пинцета поместите покровные листы над каплей паразитами вниз.
Инкубируйте влажную камеру на льду в течение пяти минут, затем при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Начните с пипетирования двух миллилитров раствора денатурации в каждую лунку шестилуночной пластины. Переложите желированные покровные листы, содержащие паразитов Trypanosoma cruzi, в раствор для денатурации и инкубируйте при осторожном перемешивании.
Для стимулирования отслоения геля. С помощью металлического шпателя осторожно переложите гель в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую один миллилитр раствора денатурации. Инкубируйте трубку с помощью надежного колпачка на нагревательном блоке.
Используйте пипетку P1000 для аспирации денатурационного раствора из микроцентрифужных пробирок. Металлическим шпателем переложите гель в чашку Петри, содержащую 10 миллилитров сверхчистой воды, и оставьте на 30 минут. С помощью одноразовой пипетки Пастера объемом три миллилитра замените сверхчистую воду в чашке, оставив гель погруженным на ночь при комнатной температуре.
На следующий день измерьте диаметр геля с помощью штангенциркуля, чтобы рассчитать расширение. Образцы были видны в виде плоского и полупрозрачного геля, который расширялся в воде от 4 до 4,5 раз. Начните флуоресцентное мечение с промывания расширенных гелевых кругов, содержащих паразитов, PBS.
С помощью лезвия бритвы разрежьте круги в центре на квадраты размером 10 на 10 миллиметров. Теперь переложите каждый квадрат в 12-луночный планшет и инкубируйте его в 500 микролитрах первичного антитела, разведенного в 2% PBS и BSA, встряхивая. Далее инкубируйте квадраты геля в шестилуночной пластине, содержащей два миллилитра PBS с 0,1%-ным полисорбатом 20 в течение 10 минут, встряхивая.
После переноса геля в 12-луночный планшет добавьте 500 микролитров вторичного антитела в PBS с DAPI и 10 микрограммов на миллилитр NHS эфира, конъюгированного с нужным флуорофором. Выдерживайте гель в течение 2,5 часов при температуре 37 градусов Цельсия при слабом перемешивании. После промывки геля трижды в полисорбате PBS 20, как и раньше, переложите гель в чашку Петри со сверхчистой водой и выдержите в течение 30 минут.
Поместите квадрат вспененного геля размером 10 на 10 миллиметров на форму с дном 35 миллиметров. Проверьте ориентацию паразитов при 10 или 20-кратном увеличении. Визуализируйте образцы в конфокальный микроскоп с 63-кратным масляным иммерсионным объективом с числовой апертурой 1,4.
При необходимости получите Z-стек, ширину каждого Z-шага и эмпирически определенное время экспозиции на пиксель, а затем получите интенсивность сигнала и оптимизируйте время сбора данных с помощью зума сканирования для эффективного увеличения, если это необходимо. Откройте Z-стек с помощью программного обеспечения для обработки изображений и сгруппируйте сложенные изображения с помощью опции «Сгруппировать проект Z» для каждого канала. Затем выберите проекцию максимальной интенсивности.
Объединяйте изображения с помощью инструмента «Объединить каналы». Выберите цвет каждого канала и добавьте масштабную линейку с помощью инструмента «Масштабная линейка» в программном обеспечении для обработки. Первичное расширение обеспечивало эффективное разрешение 70 нанометров, в то время как вторичное расширение показало коэффициенты расширения около 4,5.
Окрашивание всех трех стадий жизненного цикла T.cruzi in vitro цитоскелетными маркерами показало локализацию белка в корсете микротрубчатых и жгутиковых аксонемах. Конденсация хроматина была четко различима при окрашивании DAPI. Иммунолокализация маркеров альфа-тубулина, наложенная на пан-протеомное мечение у эпимастигот, показала, что базальное тельце, окрашенное антиальфа-тубулином и FITC, разделилось.
Пан-протеомная маркировка помогла идентифицировать различные структуры паразитов на всех этапах жизненного цикла.
