Методика позволяет проводить подтверждающую диагностику прионных заболеваний с помощью методики PrP scrapie в тканях, анализируя типы и распределение PrP scrapie для оценки карательного отклонения от известного профиля отложения PrP scrapie. Метод стандартизирован и использует специфические антитела к PrP scrapie, что позволяет визуализировать отложение PrP scrapie в тканях. Методика также дает информацию о нейроанатомической области и типе клеток.
Начните с помещения предметных стекол с тканевыми срезами в корзину для окрашивания из нержавеющей стали. Вытащите корзину в ксилольной ванне. Через три минуты выньте и снова погрузите корзину.
Чтобы удалить ксилол и регидратировать срезы, погрузите корзину в ванну с абсолютным этанолом. Через три минуты выньте и снова погрузите корзину. Высушите срезы на воздухе, прежде чем поместить их в ванну с 90% этанолом на одну минуту.
Затем перенесите секцию в ванну с 70% этанолом еще на минуту. При каждой процедуре ванны с этанолом осторожно перемешивайте скользящую корзину дважды и сливайте воду из корзины перед следующей передачей. Переложите корзину в ванну с 50% этанолом на одну минуту.
Аккуратно погрузите срезы тканей в 98%-ную муравьиную кислоту комнатной температуры на 30 минут. Промойте срезы в водопроводной воде в течение пяти минут, а затем дважды ополосните в дистиллированной воде. Используйте контейнер для окрашивания из нержавеющей стали в барокамере, заполненный 500 миллилитрами дистиллированной воды, для предварительной обработки 10-миллимолярного цитратного буфера при температуре 98 градусов Цельсия в течение 20 минут.
В целях контроля качества поместите на корзину участок клейкой индикаторной ленты автоклава для контроля температуры и давления. Как только сигнал тревоги укажет, что оборудование достигло программного времени и температуры, погрузите корзину с направляющими. Затем инициируйте программу в барокамере до заданной точки 2 и запишите начальное и конечное давление этой программы.
Для инактивации эндогенной пероксидазы погрузите корзину, содержащую срезы пробы, в ванну с 3%-ной перекисью водорода в метаноле на 30 минут. Соедините секции под проточной водой на пять минут После слива погрузите секции в солевой раствор с трис-буфером еще на пять минут. Для иммунодетекции поместите каждое предметное стекло на имеющийся в продаже держатель крышки, предварительно смоченный физиологическим раствором с трис-буфером, так, чтобы тканевая сторона была обращена к держателю, а края предметного стекла совпадали с двумя нижними точками держателя.
Следите за тем, чтобы не было пузырьков воздуха. Удерживайте держатель затвора между большим и указательным пальцами. Держите один палец на верхней части предметного стекла образца, а другой на нижней части держателя, затем поместите сборку в галерею системы.
Чтобы убедиться, что набор хорошо собран, заполните лунку между предметным стеклом и держателем физиологическим раствором с трис-буфером, не переполняя его. С этого момента убедитесь, что между держателем и предметным стеклом должно удерживаться около 80 микролитров физиологического раствора с трис-буфером. Не допускайте высыхания срезов.
Уменьшите фоновое окрашивание перед лечением первичным антителом путем предварительной инкубации образцов предметного стекла в течение 30 минут с 20% нормальной сывороткой того же вида, что и вторичный хозяин антител в физиологическом растворе, буферизованном Tris. Не промывая срезы, нанесите 200 микролитров раствора первичного антитела непосредственно в каждую лунку набора для предметного стекла и выдержите в течение 60 минут при комнатной температуре. Чтобы промыть срезы, заполните лунки солевым раствором Tris-buffer и подождите пять минут.
Повторите стирку дважды. Затем разбавьте биотинилированное вторичное антитело в концентрации от 1 до 200 в трис-буферном физиологическом растворе с 10% сывороткой лошади. Отремонтируйте необходимый объем в зависимости от количества обрабатываемых участков.
Нанесите 200 микролитров раствора вторичных антител на каждую лунку набора держателей предметных стекол. После 30 минут инкубации при комнатной температуре повторите промывку солевым раствором с трис-буфером. Для инкубации с пероксидазой авидин-биотинового комплекса готовят реагент за 30 минут до применения и наносят по 200 мкг раствора в каждую лунку держателя предметного стекла.
После этого инкубируйте тарелку-держатель в течение 30 минут при комнатной температуре. Уровень неспецифического иммуномечения у известных трансмиссивных губчатых энцефалопатий-отрицательных контрольных животных определяли для правильной интерпретации иммуномечения специфических аномальных прионных белков. Было отмечено, что нецелевое мечение антителами против PrP происходит в виде дискретного внутринейронального окрашивания мелкими частицами, нерегулярных тонких линейных нитей окрашивания в нейропиле, диффузной нетвердой маркировки в некоторых областях серого и белого вещества и диффузной цитоплазматической маркировки нейронов.
В таблице обобщено описание иммуномеченых аномальных типов прионных белков, наблюдаемых при губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота, классическом и атипичном скрепе и хроническом истощении цервидов для положительного диагноза и установленных критериев отрицательных, неубедительных и неподходящих результатов. Все шаги очень важны. pH растворов и комнатная температура являются важными характеристиками успеха этого метода.
Развитие иммуногистохимии для обнаружения как скрепи PrP, так и типа клеток может дать информацию о каждой клетке, участвующей в первичном патогенезе.
