Pressione atmosferica Imaging molecolare di tessuti biologici e biofilm da LAESI Spettrometria di Massa

Riepilogo

Ionizzazione ablazione laser elettrospray (LAESI) è una pressione atmosferica sorgente di ioni per la spettrometria di massa. Nella modalità di imaging, un medio infrarosso sonde laser le distribuzioni delle molecole attraverso una sezione di tessuto o di un biofilm. Questa tecnica presenta un nuovo approccio per diversi studi bioanalitici effettuata sotto natale condizioni sperimentali.

Abstract

Metodi di ionizzazione ambiente in spettrometria di massa permettono indagini analitiche da effettuare direttamente su un tessuto o biofilm in condizioni sperimentali di tipo nativo. Ionizzazione ablazione laser elettrospray (LAESI) ne è un esempio ed è particolarmente adatto per lo studio di acque contenenti i campioni. LAESI utilizza un medio infrarosso raggio laser (lunghezza d'onda 2,94 micron) per eccitare le molecole d'acqua del campione. Quando la soglia fluenza ablazione viene superato, il materiale del campione viene espulsa sotto forma di particolato e di questi proiettili viaggio a decine di millimetri al di sopra della superficie del campione. In LAESI, questo pennacchio ablazione viene intercettato da goccioline molto carico per catturare una frazione del materiale del campione espulso e convertire i suoi costituenti chimici in fase gassosa ioni. Uno spettrometro di massa equipaggiato con un pressione atmosferica interfaccia sorgente ionica è utilizzata per analizzare e registrare la composizione degli ioni liberati provenienti dalla zona sondato (pixel) del campione. Un interrogatorio sistematico su un array di pixel apre una via per l'imaging molecolare in modalità di analisi microsonda. Un aspetto unico di imaging LAESI spettrometria di massa è profiling profondità che, in combinazione con immagini laterali, consente tridimensionale (3D) l'imaging molecolare. Con gli attuali risoluzioni laterali e la profondità di circa 100 micron e ~ 40 micron, rispettivamente, l'imaging LAESI spettrometria di massa consente di esplorare la struttura molecolare dei tessuti biologici. Qui, passiamo in rassegna i principali elementi di un sistema LAESI e fornire linee guida per un esperimento di imaging di successo.

Protocollo

Il protocollo che segue descrive i passi principali della ionizzazione elettrospray ablazione laser (LAESI) esperimento e fornisce esempi rappresentativi per la laterale e tridimensionali (3D), immagini di animali e campioni di tessuti vegetali. Ulteriori dettagli sperimentali e tecniche può essere ottenuto da altre parti. ^1-6

1. Preparazione e montaggio del tessuto

1. Se sezionamento è necessario, utilizzare un cryomicrotome alla sezione del tessuto in 10-100 micron fette spesse a -10 a -20 ° C se non diversamente indicato per un tipo di tessuto particolare.
2. Monte sezioni su una superficie piana (ad esempio, chimicamente pre-pulito vetrino) direttamente, senza modificatori chimici. Per i tessuti sezionati, disgelo con montaggio delle sezioni e sicuro supporto del campione ad un Peltier di raffreddamento stadio subito dopo disgelo montaggio per mantenere il tessuto congelato in ogni momento durante l'analisi. Questo passaggio è necessario per ridurre al minimo / prevenire la migrazione molecolare della sezione.
3. Se necessario, utilizzare un dissipatore dotato di una ventola a basso consumo per facilitare la rimozione del calore dal Peltier stadio per mantenere il tessuto congelato.
4. In un ambiente umido per un lungo periodo di tempo (1-2 ore), per controllare condensazione di acqua o ghiaccio sulla superficie del tessuto. Condensa sul tessuto influenza negativamente le prestazioni di imaging in esperimenti LAESI ^1.
5. Se necessario, utilizzare un deumidificatore stanza o posto il campione raffreddato in una camera climatica riempito con un gas inerte (ad esempio, gas azoto secco) per evitare la condensa ^1.

2. Ottimizzazione della sorgente di ioni LAESI

La sorgente di ioni LAESI consiste in un mid-laser infrarosso, una serie di elementi ottici per la direzione della luce e messa a fuoco così come i titolari campione supplementare, componenti di raffreddamento, le fasi di traduzione, e un sistema di erogazione del solvente. La Figura 1 mostra la disposizione tipica di questi elementi rispetto ai all'ingresso della pressione atmosferica sorgente ionica di uno spettrometro di massa.

1. Come illustrato nella figura 1, la posizione del campione di 15-20 millimetri sotto l'orifizio del cono di campionamento spettrometro di massa (d _O-FP).
2. Operare un mid-IR laser a lunghezza d'onda 2,94 micron e 10 Hz frequenza di ripetizione. Attenuare la potenza laser a ~ 100 μJ / impulsi di energia.
3. Utilizzare una combinazione di specchi d'oro e una lente di messa a fuoco trasparente alla lunghezza d'onda laser (per esempio, un piano-convessa CaF ₂ o ZnSe lente) per accoppiare la energia dell'impulso laser nel campione di incidenza normale (vedi incidenza con angolo retto rispetto alla superficie del campione nella Figura 1).
4. Posizionare il medio infrarosso asse fascio 5-8 mm di fronte l'orifizio del cono di campionamento dello spettrometro di massa.
5. Regolare la posizione della lente di messa a fuoco e l'energia degli impulsi del raggio laser per ottenere la rimozione dei tessuti nel punto focale. Le dimensioni del volume ablato determinare il pixel (o voxel in immagini tridimensionali) dimensioni per l'applicazione di imaging.
6. Posizionare un emettitore nanospray in linea con l'asse di ingresso dello spettrometro di massa e in un orifizio a emettitore distanza punta di ~ 10 mm (vedi figura 1).
7. Per la electrospray, preparare una soluzione metanolo 50% con 0,1% di acido acetico o 0,1% di additivo acetato di ammonio per la modalità di ioni positivi o negativi, rispettivamente. A seconda del campione, altri solventi organici, quali acetonitrile, isopropanolo, ecc, può sostituire il metanolo a concentrazioni appropriate per l'attività di analisi. La stabilità del electrospray è cruciale per l'imaging di successo. In base alla selezione solvente, la portata e la tensione spruzzo devono essere adeguate per raggiungere spruzzo stabile.
8. Per reattivi LAESI ⁶ in applicazioni di imaging, la soluzione electrosprayed può contenere reagenti.
9. Utilizzare una pompa a siringa per fornire la soluzione electrospray attraverso l'emettitore electrospray ad una portata di circa 300 Nl / min.
10. Se l'orifizio spettrometro di massa viene mantenuta a bassa tensione (<500 V misurato contro terra), generare electrospray applicando alta tensione direttamente al emettitore elettrospray (ad esempio, 3000 V) o attraverso un raccordo metallico. Altrimenti, terra direttamente l'emettitore electrospray o mediante l'unione di metallo per stabilire elettrospray.
11. Attivare la sorgente electrospray a cono-nebulizzazione modalità per la generazione di ioni più efficiente per LAESI. Per l'effetto di variabili operative sulle modalità di spruzzatura e il loro effetto sulla spettri di massa, vedi discussioni altrove. ^5,7,8
12. Regolare con cura le distanze relative del setup LAESI per ottimizzare rendimento LAESI ioni mantenendo il fascio laser, l'emettitore, e gli assi orifizio sullo stesso piano. Si prega di trovare le istruzioni dettagliate altrove ^5.
13. Con un microscopio ottico, determinare le dimensioni laterali del cratere ablazione sul campione.
14. Per tridimensionale esperimenti di imaging LAESI, eseguire l'ablazione con impulsi individuali e di determinare la profondità di un voxel utilizzando, per esempio, lo z-stack mode in microscopia ottica ^3.

3. Imaging molecolare e analisi dei dati

Nell'esperimento di imaging, il campione di tessuto viene spostato nel piano focale del laser nelle direzioni X e Y con dimensioni passo maggiore o uguale alle dimensioni dello spot ablazione. La risoluzione spaziale è limitata dalla focalizzazione del fascio laser incidente.

1. Selezionare l'area di interesse sulla superficie del campione e ottenere la (X, Y) coordinate dei confini corrispondente.
2. Ha scelto un algoritmo gridding (ad esempio, griglia adattiva, l'imaging regione selezionata, griglia rettangolare, modello a spirale, Z scansione, ecc) con cui raster superficie del campione selezionato con tempo di permanenza per ogni pixel sopra l'area da acquisire.
3. Utilizzare un tre assi fase di traduzione e software che è in grado di rastering il campione secondo la griglia predeterminata.
4. Calcolare il tempo totale richiesto per l'imaging.
5. Disabilitare il limite di acquisizione dati in tempo dello spettrometro di massa. Se questo non è possibile, impostare il limite di acquisizione dati in tempo al valore calcolato il tempo di imaging.
6. Avviare il medio infrarosso sorgente laser ad una frequenza di ripetizione corretta di produrre sufficiente rapporto segnale-rumore nello spettro di massa entro il tempo di permanenza per ogni pixel per eseguire un esperimento di imaging LAESI laterale. Per il 3D imaging molecolare, utilizzano una frequenza di acquisizione dello spettro superiore al tasso di ripetizione sorgente laser al successo di massa analizzare gli ioni generati all'interno di un singolo impulso laser. Attendere il segnale di START per avviare la sequenza di ablazione.
7. Accendere la sorgente electrospray. Assicurarsi che ci sia una soluzione sufficiente per il tempo pieno richiesto per l'imaging.
8. Contemporaneamente avviare l'acquisizione di spettri di massa, alla metà degli IR ablazione laser, e la scansione della superficie.
9. Quando la corsa di imaging ha finito, STOP la scansione della superficie, la metà degli IR laser, e l'acquisizione dei dati.
10. Disabilitare la sorgente laser.
11. Spegnere l'alta tensione.
12. Spegnere la pompa a siringa.
13. Impostare lo spettrometro di massa in modalità Standby.
14. Spegnere il Peltier di raffreddamento dell'elettronica.
15. Chiudere il flusso di gas inerte se usato.
16. Utilizzare un software di correlare le coordinate assolute dei pixel in immagini laterale o il voxel in analisi 3D con gli spettri corrispondenti.
17. Tracciare il segnale di intensità di ioni per un selezionato m / z valore contro le coordinate assolute di analisi per ottenere immagini molecolari laterale e 3D.

4. Rappresentante Risultati

La Figura 2 dà risultati rappresentativi per alcuni tipi di tessuti importanti e modalità di imaging. Un pannello descrive un caso di una sezione di tessuto animale che è stato congelato durante l'esperimento per prevenire la disidratazione. ¹ In aggiunta, il campione si trovava in un ambiente asciutto gas azoto per evitare i vapori d'acqua ambiente da condensa sulla superficie del campione. Un 100-micron di spessore sezione coronale di un cervello di ratto (Rattus norvegicus) è stato ripreso con LAESI lateralmente. Le regioni anatomiche del cervello (vedi immagine ottico in pannello A) mostrano una buona correlazione con l'immagine molecolare ottenuto per il PC plasmalogeni (O-33: 3) e / o PE (O-36: 3) con m / z 728,559.

Pannello B mostra l'imaging 3D LAESI di un impianto di Zebra (Aphelandra squarrosa) del tessuto fogliare. Perché lascia possedere un meccanismo naturale di difesa contro la disidratazione, il campione può essere interrogato per l'ambiente circostante. ³ Il ottenute immagini 3D molecolare ha rivelato una serie di modelli di distribuzione per i metaboliti primari e secondari. Tra gli altri, acacetin con m / z 285,076 è stato rilevato al conteggio di ioni superiore nei settori giallo degli strati secondo e il terzo dalla parte superiore con una distribuzione omogenea nelle altre. Questa distribuzione d'accordo con il modello della variegatura visto in ottica dell'immagine.

Figura 1. Schematica del sistema LAESI (ES, punta emettitore electrospray; O, orifizio del cono di campionamento dello spettrometro di massa, FL, concentrandosi lente, FP, punto focale, P, Peltier fase di raffreddamento; HS, dissipatore di calore). Una parte del materiale particolato espulso durante la metà degli IR ablazione (punti rossi) si fonde con la elettrospray per produrre gocce carica seminato con molecole e ioni del campione (punti verdi). Gli ioni liberati da queste gocce sono analizzati e registrati dal spettrometro di massa.

Figura 2. Risultati rappresentativi per la laterale e 3D immaginario. LAESI ng con spettrometria di massa (A) Il pannello superiore mostra l'immagine ottica di un cervello di ratto (Rattus norvegicus) sezione coronale e l'immagine molecolare ottenuto per il PC plasmalogeni (O-33: 3) e / o PE (O-36 : 3) con m / z 728,559. La barra di scala bianca corrisponde a 1 mm. Adattato con il permesso (Riferimento ^1). Copyright 2010 American Chemical Society. (B) Il pannello in basso mostra l'imaging 3D di una foglia da un variegato Zebra pianta (Aphelandra squarrosa). Acacetin con m / z 285,076 è stato rilevato al conteggio di ioni superiore nei settori giallo degli strati secondo e il terzo dalla parte superiore con una distribuzione omogenea nelle altre. Ristampato con il permesso (Riferimento ^3). Copyright 2009 American Chemical Society.

Discussione

Tipi di tessuto differenti mostrano diversi contenuto d'acqua e resistenza alla trazione, che, a loro volta, possono influenzare le caratteristiche di ablazione dei campioni. ⁹ Per mitigare questi effetti, si desidera che i protocolli la fluenza laser, manipolazione del campione, analisi e revisione quando si passa da principali tipi di tessuto.

Per singola cella o indagini ad alta risoluzione, il medio infrarosso della luce può essere accoppiato in una fibra ottica affilato invece di una lente di focalizzazione. ¹⁰ Con il posizionamento della punta della fibra nelle immediate vicinanze delle celle selezionate in un tessuto, LAESI analisi può essere eseguita su uno livello di singola cellula.

Come un marchio senza sorgente di ioni per la spettrometria di massa a ionizzazione ambiente, ¹¹ LAESI ha dimostrato un grande potenziale per lo studio dei processi biochimici nei tessuti. Con i benefici aggiunti di analisi diretta, l'imaging laterale e 3D, LAESI è uno strumento emergente bioanalitici per il profiling così come le applicazioni di imaging.

Materiali

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mass spectrometer		Waters Co. (Milford, MA)	Q-TOF Premier
Mid-IR laser		Opotek Inc. (Carlsbad, CA)	Vibrant IR