טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים

Summary

פרוטוקול חדש להכנה מכאנית של השעיות אשכים סלולריים מחומר מכרסם, הימנעות אנזימים וחומרי ניקוי, מתואר. השיטה היא מאוד פשוטה, מהירה, לשחזור, והופכת השעיות תא באיכות טובות, אשר מתאימות למיון זרימה ומיצוי RNA.

Abstract

אשכים יונקים הם איברים מורכבים מאוד המכילים יותר מ -30 סוגי תאים שונים, כוללים תאים הסומטיים אשכים ושלבים של תאי germline שונים. ההטרוגניות הזאת היא חסרון מהותי הנוגע למחקר מהבסיסים של spermatogenesis יונקים, כפי שאוכלוסיות תאים טהורות או מועשרת בשלבים מסוימים של התפתחות זרע יש צורך ברוב הניתוחים מולקולריים ^1.

אסטרטגיות שונות כגון ^2,3 Staput, elutriation צנטריפוגלי ^1, וcytometry הזרימה (FC) ^4,5 להיות מועסקת להשיג אוכלוסיות תאי אשכים מועשרים או מטוהרים על מנת לאפשר ביטוי במחקרי גן דיפרנציאלי.

נדרש כי תאים בתרחיף עבור רוב ההעשרה / טיהור גישות. באופן אידיאלי, את ההשעיה התא תהיה נציג של הרקמה המקורית, יש שיעור גבוה של תאי קיימא וכמה multinucleates - שנוטים להיווצר בגללטבע סינסיציאלי של האפיתל seminiferous ^6,7 - וגושי תאי חוסר ^1. דיווחים קודמים שמעידים כי השעיות תא אשכים שהוכנו על ידי שיטה מכאנית באופן בלעדי בכבדות בקלות רבה יותר מאשר אלה trypsinized ^1. מצד השני, טיפולים אנזימטיים עם RNases ו / או אנזימי ריסוק כמו טריפסין וcollagenase להוביל לפירוק מולקולות ספציפי, אשר אינו רצוי עבור יישומים במורד הזרם מסוימים. התהליך האידיאלי צריך להיות קצר ככל האפשר, וכרוך במניפולציה מינימאלית, כדי להשיג שימור טוב של מולקולות של עניין, כגון mRNAs. פרוטוקולים הנוכחיים להכנת תאים מרקמות מוצקות מתלים הם בדרך כלל זמן רב, מאוד תלויים במפעיל, ועלולים לפגוע באופן סלקטיבי תאים מסוגים מסוימים ^1,8.

הפרוטוקול המובא כאן משלב את היתרונות של disaggregation מכאני לשעתקו מאוד וקצר מאוד עםbsence האנזימטית של טיפול, מה שמוביל להשעיות תא באיכות טובות, שניתן להשתמש בם לניתוח תזרים cytometric ומיון ^4, ומחקרי ביטוי גנים נסתרים ^9.

Protocol

1. הכנת השעיות תא

1. להקריב את הדגימה לשימוש בעקבות ההמלצות של הוועדות המיוחדות כגון IACUC (או שווה ערך באורוגוואי, הוועדה הלאומית לניסויים בבעלי החיים [CNEA]). במקרה שלנו, ממנת יתר של pentobarbital היה מנוהל.
2. לנתח את האשכים בעקבות נהלים שאושרו סטנדרטיים ומניחים אותם בצלחת פטרי זכוכית 96 מ"מ על קרח, המכיל 10 מ"ל של DMEM קר כקרח בתוספת 10% נסיוב עגל עוברי.
3. הסר albuginea Tunica ולחתוך את האשכים decapsulated לחתיכות מרובעות של 2 - 3 מ"מ בכל צד.
4. חלקים אלה מעובדים מכן בMedimachine, מטחנה מכאנית אוטומטית שבו הרקמה מפוצלת בתוך יחידה חד פעמית המכילה מסך נירוסטה מחורר והרוטור מתכת. כדי לעשות זאת, מקום 1 מ"ל של קר בתוספת DMEM ו4 - 5 החלקים הללו ביחידת 50 מיקרומטר חד פעמית, לעבור על disaggregator, ותהליך 50 שניות לביצוע ההוראות הפשוטות מהיצרן.
5. לשחזר את ההשעיה תא וכתוצאה מיחידת disaggregation באמצעות 3 - 5 מ"ל במזרק ללא מחט.
6. לסנן דרך רשת ניילון מיקרומטר 50, ספגה בעבר עם 0.5 מ"ל DMEM בתוספת.
7. סנן את ההשעיה שוב באמצעות רשת ספוגה 25 מיקרומטר ניילון, ומניח על קרח.
8. לספור בתא נויבאואר ולהתאים את הריכוז סלולרי ל1 - 2 x 10 ⁷ תאים / מ"ל עם DMEM בתוספת. לפחות 4 x 10 ⁷ תאים / גרם חומר אשך בדרך כלל מתקבלים.
9. לבסוף, להוסיף ל"ד (2-naphthol-6 ,8-disulfonic חומצה, מלח dipotassium) לריכוז סופי של 0.2% על מנת למנוע הצטברויות תא.
10. אופציונלי: לבדוק כדאיות תא של השעיות תא אשכים עם ערכת כדאיות זמינה מסחרי לתאים של בעלי חיים, בעקבות הוראות יצרן.

2. ניתוח תזרים cytometric

ve_content "> השתמשנו cytometer זרימת FACSVantage בקטון דיקינסון-מצוידים בליזר יון ארגון קוהירנט מכוון לפלוט ב 488 ננומטר לניתוח תאים מוכתם בריכוזים גבוהים של יודיד propidium (PI). (הנושא של כניסה לצרכן מבולבל תאים תחת לחץ כבר התייחסו במקום אחר ^9,10).

1. עבור מכתים PI, להוסיף fluorochrome בריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​להשעית התא, ודגירה במשך 10 דקות ב 0 מעלות צלזיוס בחושך.
2. כוח לייזר מוגדר 100 מגה ואט ולעבור סינון להקה 575/26 משמש לאיסוף הקרינה נפלטת-PI בfl2.
3. אנו מבצעים מדידות FC עם זרבובית 70 מיקרומטר. למיון אוכלוסיות spermatocyte, קבע מיון במצב רגיל-R או רגיל-C, באמצעות 3 טיפות ממוינות כמו מעטפה. שמרו על מדגם וצינורות איסוף ב3 - 4 מעלות צלזיוס באמצעות יחידת קירור. התאם ההפרש מדגם לנתח תאים בשיעור של 500 עד 1,500 לשנייה.
4. השתמש בתוכנת CellQuest (BD) כדי לנתחאת הפרמטרים הבאים: פיזור קדימה (FSC-H); פיזור צד (SSC-H); הקרינה נפלטת כוללת או דופק אזור (fl2-), ומשך זמן של פליטת הקרינה או דופק ברוחב (fl2-W).

לחלופין, יש לנו מועסקים צבע Hoechst החיוני 33342 לריכוז סופי של 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​וטופחו במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. ניתוח תא בוצע באמצעות Cytometer MoFlo (DakoCytomation) המצוידים בהפעלת לייזר באורך גל עירור UV בMW 25 ובאמצעות זרבובית 70 מיקרומטר. מניפולציה של נתונים בוצעה עם תוכנת פסגת v4.3 (DakoCytomation).

תוצאות

דוגמה של השעיה תא היטב פירוט רחב מאשכי עכברים שהוכנו עם הפרוטוקול המתואר כאן מוצגת באיור 1.

בהשוואה לטיפולים אנזימטיות ^6,8 ולשיטות שתוארו לעיל disaggregation מכאניים ^2, אחד המוצג כאן הוא הרבה יותר מהר, כרוך בפחות טיפו?...

Discussion

השיטה האופטימלית המתוארת כאן מאפשרת הכנה של השעיות תא מרקמת אשך מכרסם בדרך מהירה ולשעתק מאוד, הימנעות מטיפול אנזים וחומר ניקוי ושמירה על שלמות תא טובה ופרופורציות סוג. קיצורו של הנוהל (תוחלת 15 דקות כוללת נתיחת אשך, חיתוך רקמות, ועיבוד), הטיפול מינימאלי המעורבים, והיעד...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
Medimachine system	BD	340587
Medicon unit (50 μm)	BD	340591
Filcon unit (50 μm)	BD	340603
DMEM	Gibco	430-2100
Fetal calf serum	PAA	A11-151
NDA	Chemos BmbH	277081
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	287075	Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml