Isolare e Immunostaining linfociti e le cellule dendritiche da placche di Peyer murino di

Riepilogo

Vi è un crescente interesse per la comprensione delle funzioni immunologiche specifiche sottopopolazioni di cellule nelle placche di Peyer (PP), i siti primari induttivi di gut-tessuti linfoidi associati. Qui delineare protocolli paralleli per la preparazione di PP preparazioni di cellule singole per l'analisi di citometria a flusso e criosezioni PP per immunostaining.

Abstract

Placche di Peyer (PP) sono parte integrante dei tessuti linfoide associato all'intestino (GALT) e gioca un ruolo centrale nella immunosorveglianza intestinale e l'omeostasi. Antigeni particolato e microbi nel lume intestinale sono continuamente campionata da PP cellule M nel follicolo-associato epitelio (FAE) e trasportato a una rete sottostante di cellule dendritiche (DC), macrofagi e linfociti. In questo articolo, descriviamo protocolli in cui PPs murini sono (i) dissociato in sospensioni di cellule singole e sottoposti a citometria di flusso e (ii) preparato per criosezionamento e immunocolorazione. Per citometria di flusso, PP sono dissociate meccanicamente e poi filtrata attraverso membrane 70 micron per generare sospensioni di cellule singole libere delle cellule epiteliali e detriti grande. Partendo con 20-25 PP (da quattro topi), questo metodo veloce e riproducibile produce una popolazione di> 2,5 x 10 ⁶ cellule con> vitalità cellulare del 90%. Per criosezionamento, frescoPP ly isolati sono immersi in ottimale temperatura di taglio (OCT) medio, snap-congelato in azoto liquido, e quindi sezionato con un cryomicrotome. Le sezioni di tessuto (5-12 micron) sono essiccati all'aria, fissato con acetone o metanolo, e quindi sottoposti a immunomarcatura.

Introduzione

Placche di Peyer (PP) sono aggregati macroscopici organizzati follicoli linfoidi presenti in tutto l'intestino tenue di esseri umani e topi (Figura 1) e costituiscono i siti primari avviate mucosali risposte immunitarie contro antigeni alimentari, batteri commensali, patogeni microbici e vaccini orali ^1-4. A differenza di altri tessuti linfoidi periferici, come i linfonodi mesenterici, PPs mancano vasi linfatici afferenti. Come tali, le risposte immunitarie in PP sono guidati in risposta ad antigeni derivati ​​dal lume intestinale. Il campionamento di antigeni luminali è compiuta la dal follicolo-associata epitelio (FAE), che consiste di due enterociti e antigene-campionamento cellule note come cellule M. Sotto la FAE, nel sub-epiteliale cupola (SED) regione, si trova una rete di cellule dendritiche (DC), mescolate con i macrofagi, cellule B e le cellule T CD4 ^{+ 5-9.} Al centro di ogni follicl PP linfoidee sono cellule follicolari dendritiche (FDC) e una a cellule B ricco di centro in centro germinale, fiancheggiata da cellule T-zone ricche interfollicolari. Campionamento Antigen dai risultati PPs nello sviluppo di IgA + plasmablasts cellule B e le cellule effettrici CD4 ⁺ e la memoria che le sementi della lamina propria circostante e garantire l'immunità a una vasta gamma di invasori della mucosa.

Dissezione gli eventi immunologici complessi associati con il campionamento antigene, l'elaborazione e la presentazione in PP è un compito arduo, considerando che le cellule PP costituiscono solo una piccola frazione delle cellule linfoidi in totale mucosa intestinale. Per aiutare nella caratterizzazione in vitro di cellule in questo ambiente, forniamo un protocollo per la preparazione di cellule totali topo PP per analisi citofluorimetrica e funzionale, nonché un protocollo per la preparazione di PP criosezioni per immunofluorescenza e immunoistologia. Il nostro protocollo per l'isolamento, la caratterizzazione, e immunostaining di protocolli d'intesaposta cellule PP non è nuova di per sé, come dimostra il fatto che ci sono numerosi riferimenti risalgono a più di 25 anni che citano queste tecniche ^5,6,9-11. Piuttosto, il nostro protocollo prevede una snella (e visivo) Metodo per investigatori raccolta PPs per la prima volta. Le tecniche che descrivono facilmente padronanza e prontamente produrre un gran numero di cellule con> la vitalità cellulare del 90%. Il protocollo criosezionamento produce sezioni seriali altamente riproducibili ideali per la colorazione e immunofluorescenza confocale. Inoltre, il nostro protocollo integra altri due articoli recenti Giove. Il primo, di Fukuda e colleghi, descrive l'uso di saggi ligato anello ileali per valutare la diffusione dei batteri patogeni da PP cellule M ^12. L'altro, da Geem e colleghi, descrive l'isolamento e la caratterizzazione di cellule dendritiche e macrofagi dalla mucosa intestinale del mouse, ma esclude esplicitamente dalla loro analisi PP ¹³.

Protocollo

Gli animali sono stati alloggiati sotto convenzionali, esenti da organismi patogeni specifici condizioni e sono stati trattati nel pieno rispetto Institutional Animal Care del Centro Wadsworth e uso Comitato (IACUC) le linee guida.

1. Sonda gastrica

1. (Opzionale) topo ceppo Gavage di scelta con l'antigene o microbi di interesse utilizzando un 22 G x1.5-in. blunt-end ago alimentazione (Popper scientifico, New Hyde Park, NY). I volumi di consegna non deve superare i 400 microlitri per topo.

2. Isolamento delle cellule PP per Citometria a Flusso

1. Eutanasia topi da CO ₂ asfissia, secondo la cura degli animali istituzionale e uso delle commissioni (IACUC) le linee guida.
2. Pulire l'addome con il 70% di etanolo o betadine prima dell'intervento. Eseguire una laparotomia standard che coinvolge un singolo (1 cm) incisione con le forbici chirurgiche di qualità lungo la linea mediana inizio circa 1,5 cm dalla base della gabbia toracica. Esporre il percavità itoneal e identificare il cieco. Snip l'intestino terminale piccolo al ileale-cecale giunzione e rimuovere delicatamente l'intestino nella sua interezza. Fare attenzione a non estendersi troppo il tessuto intestinale mentre viene rimosso dalla cavità peritoneale.
3. Posare il piccolo intestino su un letto di tovaglioli di carta umidi o Kimwipes. Bagnare il piccolo intestino delicatamente con soluzione fisiologica per prevenire la disidratazione dei tessuti. Identificare visivamente PPs singoli posti sul lato anti-mesenterico dell'intestino (Figura 1). In genere, un mouse deve 5-10 PP visibili che sono uniformemente distribuiti dal duodeno (prossimale) a ileo (distale). In media, i topi quattro produrrà 23 PP.
4. Utilizzando curve forbici chirurgiche, PPS singoli accise delicatamente e metterli in soluzione salina bilanciata di Hank fredda (HBSS). Nota, le forbici devono essere posti curva verso l'alto sopra la PP e poi delicatamente applicata al tessuto. Accise solo il PP (non surrounding tessuto) e trasferimento in HBSS freddo.
   Nota: Tutte le incubazioni e le fasi di centrifugazione da questo punto in avanti nella sezione 2 dovrebbe essere fatto a 4 ° C per preservare la vitalità cellulare.
5. Trasferire PPs in 5 ml di dissociazione Medio Milza e incubare per 15-20 minuti a 37 ° C, mentre scuotendo vigorosamente a 250 giri al minuto. Tempo di incubazione più lungo influenzerà negativamente la vitalità cellulare.
6. Per generare una sospensione di cellule singole, PP posto su una sterile (sterilizzato) 70 filtro nylon cella um maglie e forzatamente macinare il tessuto in maglia utilizzando la base di uno stantuffo di una siringa da 1 cc. In alternativa, PPs a sandwich tra due lastre di vetro sterili microscopio smerigliato (autoclave in buste) e delicatamente macinare tessuti con un movimento avanti e indietro. Utilizzare una pipetta sterile di trasferimento per trasferire la sospensione cellulare in una provetta 5 ml Falcon.
7. Aggiungere EDTA ad una concentrazione finale di 1 mM alla sospensione cellulare. Incubare su un agitatore per5 min a temperatura ambiente.
8. Sospensione cellulare Decantare attraverso un secondo filtro 70 micron delle cellule per rimuovere eventuali aggregati rimanenti detriti cellulari o tessuti. Raccogliere le cellule in un tubo 15 o 50 ml.
9. Cellule soggette a centrifugazione dolce (5 min a 500 xg). Decantare il surnatante e risospendere le cellule in tampone di flusso, che è salina tamponata con fosfato (PBS) contenente 1% di siero fetale bovino (FCS).
10. Per determinare il numero e la vitalità cellulare, le cellule diluire 1:10 in trypan blu e ispezionare visivamente le cellule utilizzando un microscopio ottico e un emocitometro. In alternativa, un contatore di cellule Countess (Invitrogen) o uno strumento simile può essere utilizzato per enumerare automaticamente i numeri e la vitalità cellulare.
    A partire con 20-25 PPs, questo protocollo dovrebbe produrre> 2,5 x 10 ⁶ cellule totali. Ciò equivale a ~ 0,8-1,2 x 10 ⁶ cellule per il mouse.

Etichettatura degli anticorpi di cellule di citometria a flusso

Dispensare cellule (10 ⁵ per pozzetto) in pozzetti di una piastra a 96 pozzetti fondo tondo.

Piastra soggetta a centrifugazione leggera (5 min a 1000 xg), e decantare supernatante capovolgendo delicatamente la piastra.

Risospendere le cellule in tampone blocco Fc e incubare su ghiaccio per 15 min. Mentre ci sono un certo numero di commercialmente disponibili buffer blocco FC (es. ratto anti-topo CD16/CD32, BD Biosciences), è sufficiente utilizzare un mezzo trascorso da B ratto cellulare di ibridoma (ATCC 2.4.G2) che secerne un anticorpo monoclonale murino contro IgG ₁ Fcy recettori per questo passo.

Piastra soggetta a centrifugazione leggera (5 min a 1000 xg) come sopra, e decantare supernatante capovolgendo delicatamente la piastra.

Aggiungere fluoroforo anticorpi coniugati direttamente sospensioni cellulari a diluizione desiderato, e incubare su ghiaccio per 30 min con dondolo continua.

Piastra di riserva di centrifugazione dolce (5 min a 1.000 xg), e decantaresupernatante capovolgendo delicatamente la piastra.

Lavare le cellule con 100 pl di tampone di flusso.

Centrifugare piastra a 1000 xg per 5 minuti, e decantare supernatante capovolgendo delicatamente la piastra.

Risospendere le cellule 400 microlitri tampone di fissaggio, che consiste in 300 pl di tampone di flusso e 100 pl di 1% paraformaldeide in PHEM buffer (60 mM, PIPES 25 mM HEPES, 10 mM EGTA, 4 mM MgCl ₂ a pH 6).

Cellule riserva di citometria a flusso utilizzando un FACSCalibur o equivalente. Analizzare i risultati utilizzando Quest versione inglese del software Pro 5.2.

3. Preparazione di criosezioni PP

1. In anticipo di raccolta di tessuti, aggiungere ottimale temperatura di taglio (OCT) composto a base di stampi 7x7x5 mm plastica. Inoltre preparare una pozza di azoto liquido (> 750 ml) in un secchio dewar o ghiaccio.
2. Euthanize mouse e eseguire un laparotamy, come descritto sopra. Rimuovere intestino e il luogo su carta assorbente bagnato.
3. Aisolare PPs per cyrosectioning, tagliare 0,5 centimetri segmenti trasversali di piccolo intestino contenenti un unico PP e tessuto trasferimento in una capsula di Petri contenente PBS. Lavare delicatamente il lume di questi segmenti con PBS per rimuovere indesiderati detriti fecali.
4. Inserire i segmenti del tessuto intestinale in verticale all'interno di stampi di base contenenti ottobre Immergere gli stampi in azoto liquido e permettono tessuto di congelare completamente (1-2 min). Il colore del PTOM cambia da chiaro a bianco quando il tessuto è completamente congelato. . Per un raffreddamento più graduale (ad esempio, per ridurre la rottura del PTOM), la muffa immergere in un bagno di isopentano raffreddato con vapori di azoto liquido Nota: Indossare occhiali di sicurezza appropriate quando si lavora con l'azoto liquido.
5. Rimuovere stampi di base congelati dal azoto liquido con pinze e consentire lo stampo riscaldare a temperatura ambiente per il tempo necessario (~ 10-15 sec) per consentire ai bordi del blocco ottobre per ammorbidire. Per rimuovere il blocco di ghiacciato di ottobre dalo stampo, capovolgere lo stampo e premere delicatamente sulla parte posteriore per espellere il blocco su un panno pulito 4 x 4 pezzi cm foglio di alluminio. Immediatamente avvolgere il tessuto in stagnola e posto in un sacchetto campione etichettato conservati in azoto liquido o in ghiaccio secco. In alternativa, trasferire tessuto in congelatore (<-20 ° C). Utilizzare il tessuto entro una settimana, altrimenti i blocchi diventa fragile con l'età.

Criosezionamento

6. Cryosection il tessuto utilizzando un Leica CM3050S cryomicrotome o equivalente. La temperatura della camera del criostato deve essere impostato a -21 ° C.
7. Tendere sezioni che sono 12-14 pm di spessore.
8. Raccogliere sezioni su Fisher SuperFrost Plus (o equivalente) vetrini per microscopio e ispezionare visivamente con un basso livello di potenza microscopio ottico. Se più sezioni sono stati raccolti su una diapositiva, in modo che essi sono raggruppati insieme per le applicazioni di colorazione a valle.
9. Negozio di tscivola a temperatura ambiente in una scatola e, idealmente, li usano in pochi giorni.

Etichettatura di anticorpi criosezioni e analisi al microscopio confocale

10. Immergere i vetrini in acetone (o metanolo) in vaso tessuto colorazione o rack per 2 min. Incubazione prolungato può causare tessuti per staccare dalla diapositiva.
11. Trasferire diapositive a vaschetta di colorazione nuovo e lavare 3 volte con PBS-T (1X PBS con 0,05% Tween-20) per 3 min ciascuna.
12. Restringere le sezioni con una penna idrofobo ImmEdge. Questo farà sì che i reagenti e gli anticorpi rimarrà confinato in quell'area durante l'incubazione.
13. Incubare i vetrini in tampone di blocco (siero di capra 2% in PBS) per 30 min a 37 ° C in una camera umidificata, al riparo dalla luce.
14. Incubare vetrini con tampone blocco Fc (vedi sopra) per 10 min a 37 ° C.
15. Immergere i vetrini in PBS-T e asciutto intorno sezioni utilizzando Kimwipes o su altri tessuti assorbenti.Fare attenzione a non toccare le sezioni di tessuto reali.
16. Sezioni tissutali overlay con soluzione di anticorpo primario e incubare per 30 min a 37 ° C in una camera umidificata. Anticorpo primario è normalmente diluita in tampone di blocco ad una concentrazione finale di 20 pg / ml. L'uso di anticorpi marcati direttamente primari è desiderabile, perché ben tre anticorpi possono essere combinati direttamente a questa fase. Anticorpi marcati direttamente anche eliminare la necessità di ulteriori passaggi di incubazione dell'anticorpo.
17. Lavare i vetrini 3 volte (5 minuti ciascuno) per immersione in PBS.
18. Se necessario, i vetrini incubare con anticorpi secondari pertinenti per 30 min a 37 ° C in una camera umida.
19. Lavare i vetrini 3 volte (5 minuti ciascuno) per immersione in PBS.
20. Incubare i vetrini per 4 min in 1% paraformaldeide in tampone PHEM, come descritto sopra.
21. Sciacquare i vetrini con PBS per 1 min.
22. Zona intorno a secco sezioni utilizzando Kimwipes o altri assorbireent tessuto. Fare attenzione a non toccare le sezioni di tessuto reali. Usando una pipetta o contagocce, posizionare con cura una goccia di prolungare medie Oro montaggio diretto sulla sezione. Applicare un coprioggetto di vetro sul supporto di montaggio avendo cura di evitare bolle. Utilizzare carta assorbente per assorbire l'eccesso di terreno di montaggio.
23. Seal coprioggetti per vetrini da microscopio con smalto commerciale e lasciare asciugare all'aria.
24. Visualizzare le diapositive con una Leica TCS SP5 o equivalente microscopio confocale.

Risultati

Analisi citofluorimetrica di sospensioni monodisperse del totale delle cellule PP rivela una chiara distinzione tra preparazioni di cellule buone e poveri. In preparazioni di cellule buoni rapporti con oltre l'80% la redditività, la maggior parte delle cellule dimostrano alta forward scatter (FSC), un indicatore di volume cellulare alta, e disperdere lato basso (SSC), un indicatore di granularità delle cellule basso (Figura 2A). In questo esperimento, abbiamo anche volutamente preparato un "c...

Discussione

In questo articolo, abbiamo fornito protocolli paralleli per la preparazione di PP preparazioni di cellule singole per l'analisi di citometria a flusso e funzionale e criosezioni per immunostaining. Entrambi i metodi sono altamente riproducibili e facilmente accessibile, fornito un citofluorimetro e criostato sono disponibili. Per investigatori prima volta è opportuno sottolineare che, rispetto alla milza, produzioni di cellule totali di PP sono relativamente scarse. Tuttavia, il protocollo delineiamo generalmente ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Voce	Azienda	Cat. #	Commenti (opzionale)
Ottobre Compound	Tissue-Tek	4583
7x7x5 Stampi base mm	FISHERBRAND	22-363-552
ImmEdge Pen	Vector Labs	H-4000
SuperFrost Plus Slides	Thermo Scientific	4951
Bordo Rite Lama	Thermo Scientific	4280L
Anti-Mouse CD11c-PE	eBioscience	17-0114-82
Anti-Mouse CD45R/B220-APC	BD Pharmigen	553092
Anti-Mouse CD3-FITC	BD Pharmigen	561798
Anti-Mouse CD4-PE	BD Pharmigen	553652
Anti-Mouse CD8-PE	BD Pharmigen	553032
Anti-topo CD19-PerCP	BioLegend	115531
Sale di Hank soluzione equilibrata (HBSS) senza rosso fenolo	Fisher Scientific	14175-079
70 micron filtro cella	BD Falcon	352350
Medio Spleen dissociazione	Stem Cell Technologies	7915
Siero di capra	Invitrogen	16210-072
Fc Block	ATCC 2.4.G2	HB-197	Supes ottenuto da 2.4.G2 linea cellulare
Scissor curvo	FST	14061-09
Criostato	Leica	3050S
FACS Calibur	BD
Contessa Cella contatore	Invitrogen
Ematossilina	Richard Allan	7211
Eosina	Richard Allan	71304
Formalina	Starplex scientifico	3661
			Tabella 1. Reagenti e apparecchiature utilizzati in questo studio.