Rápidas de teste colorimétrico para Qualitativamente Distinguir RNA e DNA em amostras biomoleculares

Resumo

Um conjunto de ensaios colorimétricos é descrito para a proteína rapidamente distinguir, RNA, DNA, e re-dução de açúcares em amostras biomoleculares potencialmente heterogéneos.

Resumo

Experimentação Biochemical geralmente requer o conhecimento preciso, numa fase precoce, do ácido nucleico, proteínas, e outros componentes biomoleculares em espécimes potencialmente heterogéneos. Os ácidos nucleicos podem ser detectados através de várias abordagens estabelecidas, incluindo os métodos analíticos que são espectrofotométrica (por exemplo, A _260), fluorométrico (por exemplo, a ligação de corantes fluorescentes), ou colorimétrico (nucleósidos específicos de reacções químicas cromogénicos). ¹ Ainda que não se pode distinguir facilmente RNA a partir de DNA, a A ₂₆₀ / A ₂₈₀ rácio é geralmente utilizado, uma vez que proporciona um método simples e rápido ² Avaliação do teor relativo de ácido nucleico, que absorve predominantemente próximo de 260 nm e proteína, o qual absorve principalmente próximo de 280 nm. Coeficientes <0,8 são considerados como indicativos de "puras" amostras de proteína, enquanto que o ácido nucleico puro (NA) é caracterizada por taxas de> 1,5 ^3.

HoWever, há situações em que o conteúdo de proteína / NA não pode ser tão claramente ou de forma confiável inferida a partir de simples uv-vis medições espectrofotométricas. Por exemplo, (i) As amostras podem conter uma ou mais proteínas que são relativamente desprovida dos aminoácidos aromáticos responsáveis ​​pela absorção a 280 nm (≈ Trp, Tyr, Phe), como é o caso com algumas pequenas proteínas de ligação ao RNA e (ii) as amostras podem exibir intermédios A ₂₆₀ / A ₂₈₀ ratios (~ 0,8 <~ 1.5), onde o teor de proteínas / NA é muito menos clara e pode mesmo reflectir alguma afinidade elevada associação entre a proteína e os componentes de NA. Para tais situações, descrevemos aqui um conjunto de ensaios colorimétricos para distinguir rapidamente RNA, DNA e açúcares redutores, em uma amostra potencialmente misto de biomoléculas. Os métodos baseiam-se na sensibilidade diferencial de pentoses e outros hidratos de carbono para a Benedict, Bial (orcinol), e (difenilamina) Dische de reagentes, os protocolos podem ser simplificados comconcluída em questão de minutos, sem quaisquer passos adicionais de ter de isolar os componentes. Os ensaios podem ser realizados em paralelo, para diferenciar entre o RNA e de DNA, bem como indicar a presença de açúcares redutores livres tais como a glicose, frutose, ribose e (Figura 1).

Introdução

Grande parte da biologia das células ocorre através de interacções moleculares envolvendo DNA e RNA. ⁴ Estes ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente (AN) interagem uns com os outros, ^{5, 6,} com as proteínas e com uma série de compostos de moléculas pequenas e ligandos in vivo (por exemplo, catiões divalentes ^7). As interacções podem ser de curta ou de longa duração (cineticamente), pode variar desde moderada a alta para baixa afinidade (força termodinâmica), e também podem apresentar uma variação substancial nas propriedades químicas e especificidade - algumas associações são bastante específicas (por exemplo, DNA · · · fatores de transcrição, RNA · · · fatores de splicing), enquanto outras interações são necessariamente muito mais genérico (por exemplo, o DNA · · · bacterianas proteínas de histona-like HU ^8). Não-específicas interações com AN pode ter consequências práticas para experimentos in vitro envolvendo misturas de biomolecules, uma vez que é possível, e mesmo provável, que alguns AEs vai associar com as biomoléculas de interesse, pelo menos em alguns subconjuntos de condições experimentais que está sendo usado (a força iónica, o pH da solução, etc.)

Considere-se, por exemplo, a produção de uma proteína de interesse (POI), através de sobre-expressão heteróloga da proteína recombinante em Escherichia coli da cultura de células; tal procedimento é realizado rotineiramente em virtualmente qualquer laboratório de biologia estrutural ⁹ Na preparação para experiências adicionais, tais. como caracterização bioquímica / biofísica, cristalização, etc., os esforços iniciais geralmente o foco sobre a obtenção de uma quantidade suficiente do PI em como uma forma pura quanto possível, de preferência como um espécime quimicamente homogéneo e biofísico monodisperso. Após a ruptura das células hospedeiras, os estágios iniciais de um fluxo de trabalho de purificação típico visam isolar o POI de E. proteínas de E. coli, ácidos nucleicos, fragmentos de paredes de células,e outros componentes do lisado celular. No entanto, o anfitrião AN pode co-purificar com o POI por várias razões fisico-químicas - um POI altamente básica pode não especificamente hospedeiro suspenso DNA / RNA, o POI pode ter uma actividade de ligação genérico NA (por exemplo, o HU acima mencionado); o POI pode ser um bastante específico proteína NA-ligação, mas exibem reactividade cruzada com RNAs hospedeiras ou DNAs; hospedeiro AN pode interagir com uma matriz de cromatografia e, assim, apenas co-eluir com o POI, e assim por diante. Indiscriminada, de alta afinidade de ligação do anfitrião AN a um PI pode representar um sério problema, porque as impurezas NA provavelmente vai interferir com os experimentos a jusante (por exemplo, ensaios de anisotropia de fluorescência de POI • RNA vinculativo ^10). Alternativamente, POI imprevisto · · · NA associações também podem ser vistos por acaso, como tais interações iluminar a capacidade do POI de ligação de ácidos nucleicos. De qualquer maneira, se AN são componentes-chave ou contaminantes, deve-se primeiro quantificar eidentificar o tipo (DNA, RNA) de co-purificação AN em preparação para ensaios a jusante.

Diversos métodos analíticos para a detecção de existir e quantificando AN numa amostra. A maior parte dos métodos disponíveis são fundamentalmente ou espectrofotométrica (por exemplo, um ₂₆₀ valores de absorvância e A ₂₆₀ / A ₂₈₀ rácios), fluorométrico (por exemplo, a ligação do tiazole de laranja ou de outros corantes fluorescentes para NA), ou colorimétrico (susceptibilidade de nucleósidos para as reacções químicas cromóforos que rendimento de absorção na região do UV-Vis do espectro electromagnético), tal como foi recentemente descrito por De Mey et al. ^{1 No} entanto, o passo crucial de identificar o tipo de polinucleótido como RNA ou DNA está para além do alcance de muitos destes quantificação abordagens. Aqui nós fornecemos um conjunto de ensaios colorimétricos para rapidamente identificar os tipos de componentes de NA em uma amostra protéica.

Os protocolos aqui descritos cum ser eficientemente executados sem passos adicionais de isolar as impurezas potenciais de NA, e dependem do ensaio de Benedict para açúcares redutores ^11, o ensaio de orcinol para pentoses ^{12,13, 14,15} e reacções difenilamina de 2'-deoxypentoses (Figuras 1 e 2) . O teste de Benedict (Figura 2a) utiliza a capacidade da forma linear, de cadeia aberta (aldeído) com um açúcar aldose para reduzir Cu ^{2 +,} com a oxidação concomitante de carbonilo do açúcar a uma porção de carboxilato de metilo e de produção de Cu ₂ O como um precipitado vermelho insolúvel. Esta reacção irá testar positivo com livre açúcares redutores tais como aldoses e cetoses (que converter as aldoses correspondentes, através de intermediários enediol), mas não com os açúcares pentose que estão bloqueados em forma cíclica, como parte do esqueleto covalente de um DNA ou RNA de polinucleótido. Devido à exigência de um minimalista funcionalidade hemiacetal livre, co outrompounds que poderia teste positivo neste ensaio - e, portanto, actuar como potenciais interferentes - incluem α-hidroxi-cetonas e oligossacarídeos curtos (por exemplo, a maltose dissacarídeo). Tanto do Bial orcinol (Figura 2b) e difenilamina Dische (Figura 2c), as reacções são baseados em destruição inicial da espinha dorsal de polinucleótidos, por despurinação do nucleósido e ácido-ou ainda catalisada por base a hidrólise dos nucleótidos mãe, para se obter furan-2 -carbaldeído (furfural) derivados; estes derivados reagem então com um fenol ou poli-hidroxi tais como orcinol (Bial) ou difenilamina (Dische de) os reagentes para formar produtos de condensação cor de estrutura química em grande parte desconhecida. O DNA versus ARN especificidade do ensaio do Dische decorre do facto de o açúcar pentose deve ser 2'-desoxigenada, a fim de ser susceptível à oxidação a ω-hydroxylevulinyl aldeído, o qual reage posteriormente com difenilaminasob condições ácidas, para se obter um condensado de azul brilhante (Figura 2c). Utilizando os protocolos descritos aqui simplificadas, verificou-se que estas reacções colorimétricas açúcar específicos podem diferenciar entre ARN e ADN, e também irá indicar a presença de açúcares redutores livres tais como a glicose, frutose, ribose, ou numa amostra biomolecular.

Protocolo

1. Ensaio de Bento XVI para a Redução Açúcares

1. Prepara-se uma quantidade adequada de reagente de Benedict - 940 mM de carbonato de sódio anidro, 588 mM de citrato de sódio desidratado, 68 mM de cobre penta-hidratado (II). Este reagente pode ser armazenada à temperatura ambiente (RT) durante pelo menos seis meses sem qualquer mudança notável na reactividade.
2. O reagente acima é 6x. Assim, para 600 ul de reacções, adicionar 100 ul de reagente de Benedict para um tubo limpo de microcentrífuga de 1,5 ml (por exemplo, Eppendorf marca), por amostra a ser testada.
3. Adicionar em qualquer lugar a partir de 10 ul a 500 ul de amostra a este tubo, o volume óptimo pode ser determinado com base na intensidade de formação de cor num ensaio de funcionamento inicial. Se a amostra suficiente estiver disponível, então começar tais ensaios no volume de amostra máximo possível (isto é, cinco sextos do volume de reacção total, 500 ul de amostra, neste caso), e depois dilui-se em ensaios subsequentes.
4. Adicionar DDH ₂ O para o tuser para trazer o volume final de 600 ul; misturar a solução por agitação em vórtex ou pipetagem.
5. Incubar as amostras durante 20 minutos num banho de água a ferver.
6. Retirar a amostra do banho de aquecimento e permita que arrefeça à temperatura ambiente durante 10 min.
7. Centrifugar o tubo de amostra a> 9300 x g (~ 10.000 rpm em um FA45-24-11 Eppendorf rotor de ângulo fixo) durante 5 min, de modo a sedimentar as partículas de matéria, este passo é mais importante para estudos quantitativos e não qualitativos.
8. Alíquota do sobrenadante deste tubo numa cuvete limpa.
9. Em branco o espectrofotômetro UV-Vis com água.
10. Medir a absorvância da amostra a 475 nm.

2. Ensaio orcinol Bial para Pentoses Açúcares

1. Prepara-se uma quantidade apropriada de reagente fresco de Bial - 24,2 mono-hidrato de orcinol mM (ver Figura 2b para a estrutura deste composto), HCl 6 M, 0,025% w / v de cloreto férrico hexahidratado Nota.:Para um armazenamento prolongado, reagente a Bial pode ser preparado como duas soluções de reserva separadas: (i) um reagente de [0,05% w / v FeCl3 • 6H ₂ O em HCl concentrado] e (ii) mono-hidrato de Reagente B mM [422 orcinol preparado em 95 % de etanol]. Um reagente pode ser armazenada à temperatura ambiente durante seis meses; Reagente B podem ser armazenadas a 4 ° C durante um mês, coberta com papel de alumínio para limitar a exposição à luz. Estas soluções stock são misturados a 15 (A): 1 (B) proporção v / v antes de usar.
2. O reagente acima é 2x. Assim, para as reacções 1,0 ml, adicionar 500 ul de reagente Bial para um tubo limpo de microcentrífuga de 1,5 ml, por amostra a ser ensaiada.
3. Adicionar em qualquer lugar a partir de 10 ul a 500 ul de amostra a este tubo. Conforme nota 1.3 (acima), se amostra suficiente estiver disponível, então começar reacções de ensaio utilizando o volume de amostra máximo possível (isto é, a metade do volume total de reacção de 500 ul de amostra, neste caso) e dilui-se a partir daí.
4. Adicionar DDQ ₂ O para o tubo para levar a final de volume de 1,0 ml; misturar a solução por agitação em vórtex ou pipetagem.
5. Incubar as amostras durante 20 minutos num banho de água a ferver.
6. Retirar a amostra do banho de aquecimento e permita que arrefeça à temperatura ambiente durante 10 min.
7. Centrifugar o tubo de amostra a> 9300 x g (~ 10.000 rpm em um FA45-24-11 Eppendorf rotor de ângulo fixo) durante 5 min, de modo a sedimentar as partículas de matéria, este passo é mais importante para estudos quantitativos e não qualitativos.
8. Alíquota do sobrenadante deste tubo numa cuvete limpa para inspecção visual.
9. Para a análise semi-quantitativa, o ensaio em branco espectrofotómetro uv-vis com água e medir a absorvância da amostra a 660 nm cuvete.

3. Ensaio Dische de difenilamina para 2'-deoxypentose Sugars

1. Prepara-se uma quantidade adequada de reagente de difenilamina Dische - 60 mM difenilamina, 11 M de ácido acético glacial, 179 mM de ácido sulfúrico, 62% v / v de etanol. Este reagente pode ser previamentepared antecipadamente e guardado à temperatura ambiente num recipiente escuro, ou coberto com a folha, para limitar a exposição à luz. Devido à sensibilidade à luz o reagente não deve ser armazenado indefinidamente, embora, na prática, podem ser preparados a cada dois a três meses, sem qualquer alteração aparente na reactividade.
2. O reagente acima é 2x. Assim, para as reacções 1,0 ml, adicionar 500 ul de reagente de Dische para um tubo limpo de microcentrífuga de 1,5 ml, por amostra a ser ensaiada.
3. Adicionar em qualquer lugar a partir de 10 ul a 500 ul de amostra a este tubo. Conforme nota 1.3 (acima), se amostra suficiente estiver disponível, então começar reacções de ensaio utilizando o volume de amostra máximo possível (isto é, a metade do volume total de reacção de 500 ul de amostra, neste caso) e dilui-se a partir daí.
4. Adicionar DDQ ₂ O para o tubo para perfazer o volume final para 1,0 ml; misturar a solução por agitação em vórtex ou pipetagem.
5. Incubar as amostras durante 20 minutos num banho de água a ferver.
6. Retirar a amostra do banho de aquecimento e alow-a arrefecer à temperatura ambiente durante 10 min.
7. Centrifugar o tubo de amostra a> 9300 x g (~ 10.000 rpm em um FA45-24-11 Eppendorf rotor de ângulo fixo) durante 5 min, de modo a sedimentar as partículas de matéria, este passo é mais importante para estudos quantitativos e não qualitativos.
8. Alíquota do sobrenadante deste tubo numa cuvete limpa para inspecção visual.
9. Para a análise semi-quantitativa, o ensaio em branco espectrofotómetro uv-vis com água e medir a absorvância da amostra a 600 nm cuvete.

4. Outras Notas de uso

1. As seguintes classes de moléculas são compostos de referência apropriados para reacções de controlo positivo e negativo para cada ensaio:
   • Benedict - positivo = livre ribose, frutose, glicose; negativa = RNA, DNA, ATP, etc. (Qualquer sacárido falta uma funcionalidade sem açúcar redutor)
   • Bial - positivo = RNA (por exemplo, extrato de levedura de padeiro), ribose, ATP, UMP, negativo = bovina Serhum albumina (BSA) ou qualquer outra proteína
   • Dische de - positivo = DNA (por exemplo, timo de vitela); negativa = RNA, ATP, etc. (Qualquer nucleotídeo não-2'-desoxigenado)
2. Estes ensaios foram encontrados para ser bastante resistentes a compostos frequentemente utilizados na purificação de proteínas, por exemplo, os sais comuns, tais como NaCl, (NH _{4) 2} SO _4, e K ₂ SO ₄ não interferiu, e as reacções aparecem geralmente afectada pela o conteúdo do diluente. Detergentes ou agentes caotrópicos, tais como ureia podem afectar a reactividade dos ensaios, se o pH é altamente básico, um neutro a gama de pH ácida é geralmente mais óptimo para a de Bial e ensaios Dische, porque a química de reacção subjacente (ver o texto e os protões na Figura 2b, c). Potencialmente subótimas condições de reação, interferentes suspeitos, etc. devem ser testadas numa base de caso-a-caso, utilizando-se o controlo positivo e negativo experimentos wom os compostos de referência.

Resultados

Os resultados são mostrados na Figura 3 para a aplicação destes ensaios colorimétricos para os compostos de referência conhecidos. Representativos dos dados qualitativos são mostradas para (a) a Benedict, Bial de orcinol (b), e Dische de difenilamina (c) ensaios, e as curvas-padrão para estes três ensaios estão apresentados na Figura 4. Em painéis 3 (ac), os painéis da esquerda mostram as experiências positivas / negativas de controlo utilizando analitos adequadamente reacti...

Discussão

Os ensaios colorimétricos aqui apresentados oferecem uma abordagem simples para avaliar rapidamente a natureza química das misturas biomoleculares, tais como os que são encontrados quando a purificação de proteínas, RNAs ou complexos de lisado de células inteiras, em preparação para estudos posteriores. Como biologia estrutural prossegue montagens mais semelhante à nativa, desafios progressivamente maiores, tais como a heterogeneidade da amostra, serão colocados pelos complexos intrincados e multi-compo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente ou equipamento	Fornecedor / empresa	Número de catálogo	Comentários, notas
Carbonato de sódio anidro	Fisher Scientific	S263
Di-hidrato de citrato de sódio	Sigma	S-4641
De cobre penta-hidratado (II)	VWR	VW3312-2
Monohidratada orcinol	Sigma-Aldrich	O1875
HCl concentrado	VWR	BDH3030
Hexa-hidrato de cloreto férrico	Sigma	F-2877
Difenilamina	Aldrich	112763
Ácido acético glacial	Fisher Scientific	A28
Ácido sulfúrico	Sigma-Aldrich	258105
Etanol	Koptec	V1101
Ribose	Sigma	R-7500	prep a 1% w / v de H 2 O
Ácido ribonucleico de fermento de padeiro (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	prep a 10 mg / ml em H 2 O; armazenar a -20 ° C
Ácido desoxirribonucleico (sal de sódio), a partir de timo de vitelo	Sigma	D1501	prep a 10 mg / ml em H 2 O; armazenar a 4 ° C
			Reagentes, Equipamentos e Segurança Materiais estão listados na following tabela na ordem em que aparecem na secção de protocolo. Salvo indicação em contrário (acima), todos os reagentes podem ser armazenados à temperatura ambiente e iluminação. Para todos os itens não listados a seguir (por exemplo, tubos de microcentrífuga), a marca usual / modelo / variedade encontrada num laboratório padrão bioquímica pode ser utilizada (por exemplo, Eppendorf marca tubos de 1,5 ml de microcentrífuga). Padrão tubos de microcentrífuga de plástico deve ser usado para as etapas que envolvem centrifugação (por exemplo, para material de sedimento de partículas próximo da extremidade de cada protocolo). Nenhum material em particular é preferível, desde que os tubos podem ser selados, os tubos de polipropileno típicos encontrados em laboratórios de bioquímica funcionar bem. Em termos de preocupações de segurança e eliminação de resíduos, precauções padrão de laboratório (óculos de segurança, exaustores) deve ser exercida em pré-apara, trabalhando com, e descarte de soluções contendo acético concentrado, ácido clorídrico, ou ácido sulfúrico. Para reagentes orgânicos, tais como orcinol ou diphenilamina, luvas de borracha nitrílica são preferíveis ao látex comum (borracha natural) variedade.