Agroinfiltration eficiente de las plantas para la expresión transitoria de alto nivel de proteínas recombinantes

Resumen

Las plantas ofrecen un sistema novedoso para la producción de proteínas farmacéuticas a escala comercial que es más escalable, rentable y seguro de expresión paradigmas actuales. En este estudio, se presenta un enfoque simple y conveniente, y escalable para introducir meta-gen que contiene Agrobacterium tumefaciens En plantas para la expresión transitoria de proteínas.

Resumen

Cultivo de células de mamíferos es la plataforma importante para la producción comercial de vacunas humanas y proteínas terapéuticas. Sin embargo, no puede satisfacer la creciente demanda mundial de productos farmacéuticos, debido a su limitada capacidad de ampliación y alto costo. Las plantas han demostrado ser una de las plataformas de producción farmacéuticas alternativas más prometedoras que son robustas, escalable, de bajo coste y seguro. El reciente desarrollo de vectores basados ​​en virus ha permitido la expresión transitoria rápida y de alto nivel de proteínas recombinantes en plantas. Para optimizar aún más la utilidad del sistema de expresión transitoria, se demuestra una metodología simple, eficiente y escalable para introducir objetivo-gen que contiene Agrobacterium en tejido de la planta en este estudio. Nuestros resultados indican que tanto agroinfiltración con jeringa de vacío y métodos han dado lugar a la introducción eficiente de Agrobacterium en las hojas y de producción robusta de dos proteínas fluorescentes, GFP y DsRed. Por otra parte,demostramos las ventajas únicas que ofrece por ambos métodos. Infiltración de jeringa es simple y no necesita un equipo costoso. También permite la flexibilidad para infiltrarse ya sea toda la licencia con un solo gen diana, o para introducir genes de múltiples objetivos en una hoja. Por lo tanto, se puede utilizar para la expresión a escala de laboratorio de proteínas recombinantes, así como para la comparación de diferentes proteínas o vectores de rendimiento o expresión cinética. La simplicidad de la infiltración de la jeringa también sugiere su utilidad en la escuela secundaria y la educación universitaria para el tema de la biotecnología. Por el contrario, la infiltración de vacío es más robusto y puede ser mayor escala para la fabricación comercial de proteínas farmacéuticas. También ofrece la ventaja de ser capaz de agroinfiltrate especies de plantas que no son susceptibles para la infiltración jeringa como la lechuga y Arabidopsis. En general, la combinación de jeringa y agroinfiltración de vacío proporciona a los investigadores y educadores un simple, eficiente y robustometodología para la expresión de proteína transitoria. Además, facilitará en gran medida el desarrollo de proteínas farmacéuticas y promover la educación científica.

Introducción

Desde la década de 1970, las plantas han sido explorados como alternativas a los cultivos de células de mamíferos, insectos, y bacteriana para la producción comercial de proteínas recombinantes y proteínas terapéuticas ^1. Sistemas a base de plantas para la expresión de los productos biofarmacéuticos han demostrado ser prometedores en los últimos años varios nuevos tratamientos para enfermedades, como la enfermedad de Gaucher ^2, y la gripe aviar H5N1 ^3, han demostrado tener éxito en los ensayos clínicos. El desarrollo de mecanismos competentes para la expresión de proteínas recombinantes en plantas en las décadas desde los primeros experimentos se ha creado el potencial para los sistemas basados ​​en plantas para alterar el paradigma actual de la producción de proteínas por tres razones principales. En primer lugar, hay una disminución notable en coste como biorreactores de mamíferos, insectos, y bacteriana requieren considerables costos de inicio, medios de cultivo costosos, complicados y procesos para la purificación aguas abajo ^4. La creación de plantas transgénicas estableslíneas también les permite superan la escalabilidad de otros sistemas de expresión como las plantas que expresan proteínas podrían ser cultivados y cosechados a escala agrícola ^5. En segundo lugar, los sistemas de expresión basados ​​en plantas reducen significativamente el riesgo de transmitir un patógeno humano o animal desde el host expresan la proteína a los seres humanos, lo que demuestra la superioridad en la seguridad pública ^6. Por último, las plantas utilizan un sistema de endomembranas eucariota que es similar a las células de mamíferos, lo que permite apropiada modificación post-traduccional de proteínas, incluyendo glicosilación y el ensamblaje de las proteínas de la subunidad múltiple ^7. Esta capacidad pone los sistemas a base de plantas por delante de los basados ​​en sistemas procariotas, tales como bacterias, ya que un número más amplio de proteínas farmacéuticas recombinantes, incluyendo anticuerpos monoclonales (mAb), tienen una estructura más complicada y requerir extensas modificaciones posteriores a la traducción o de montaje ^8.

Hay dos grandes aprodolores de la expresión de proteínas recombinantes en plantas. El primero es el desarrollo de una línea transgénica de manera estable, donde el ADN que codifica para la proteína diana se clona en un casete de expresión y se introduce a cualquiera de los genomas nucleares o de cloroplastos. De este modo, el ADN extraño se convierte en heredables a través de las generaciones sucesivas y permite enormemente mejorado escalabilidad, mucho más allá de la de otros sistemas de expresión ^1. La introducción de ADN exógeno al genoma nuclear se logra por lo general por la infección de Agrobacterium tumefaciens del tejido de la planta o, con menos frecuencia, por bombardeo con microproyectiles de los tejidos ^9. Las hormonas vegetales se utilizan entonces para inducir la diferenciación y el crecimiento de tejido de la planta transgénica, tales como raíces y hojas. La transformación del genoma del cloroplasto no se puede lograr con A. tumefaciens, pero depende enteramente de oro o tungsteno recubiertas con ADN dispararon balísticamente en las células vegetales. El segundo método de expresión de recombinaciónproteína nt de plantas es a través de la expresión transitoria ^10. En este escenario, los vectores derivados de virus que albergan el gen de interés se entregan a través de A. tumefaciens a plantas completamente desarrolladas a través de un proceso llamado agroinfiltration. En lugar de integrarse en el genoma de la planta, la construcción del gen entregado entonces comenzará a dirigir la producción transitoria de la proteína deseada, que se puede recoger y aislado después de un corto período de incubación. Expresión transitoria de genes ofrece la ventaja de una mayor acumulación de proteínas en general, así como una mejora del tiempo de producción de proteínas, como las plantas estarán listas para la cosecha de aproximadamente 1-2 semanas después de la agroinfiltración ^11. Esto es significativamente más rápido que los procesos de generación, selección, y la confirmación de líneas estables de plantas transgénicas, que pueden tardar varios meses a un año. Sin embargo, esta es también la limitación del sistema de expresión transitoria, ya que no dará lugar a la planta genéticamente estable lines que se pueden utilizar para generar un banco de semillas para la producción comercial a gran escala. A pesar de esto, se han desarrollado enfoques para mejorar la expresión transitoria a gran escala. Aquí se demuestra un método de generación de proteínas que expresan plantas de Nicotiana benthamiana transitorios usando vectores virales deconstruidos entregados por A. tumefaciens.

Dos métodos principales se están desarrollando para la entrega de A. tumefaciens en el tejido vegetal: Banco infiltración escala mediante una jeringa y la infiltración a gran escala a través de la cámara de vacío. Ambos protocolos se describen aquí usando N. benthamiana, que está estrechamente relacionado con la planta de tabaco común, ya que la planta huésped para la expresión transitoria de dos proteínas fluorescentes: la proteína fluorescente verde (GFP) de la medusa Aequorea victoria y la proteína fluorescente roja de Discosoma de coral (DsRed) ^12,13. N. benthamiana es la planta huésped más común paraproteína recombinante, ya que es susceptible de transformación genética, puede producir grandes cantidades de biomasa con rapidez, y es un prolífico productor de semillas para la producción de ampliación ^14. Otra ventaja de la utilización de N. benthamiana como huéspedes para la expresión de la proteína es la disponibilidad de una variedad de vectores de expresión de ^2,5. En este estudio, dos vectores virales deconstruido, uno basado en un virus del mosaico del tabaco (TMV) ARN replicón sistema (vectores magnICON) y la otra derivada del virus del enanismo amarillo del frijol (BeYDV) sistema de replicón de ADN (vectores geminiviral) ^{4,11, 15-18,} se utilizan para llevar el gen GFP y DsRed y entregarlos en N. células benthamiana mediante A. tumefaciens. Tres construcciones de ADN serán utilizados para GFP o expresión DsRed con vectores magnICON. Ellos incluyen 'módulo (pICH15879) que contiene el promotor y otros elementos genéticos para la conducción de la expresión del gen diana, el 3' del módulo 5 que contiene el gen de interés (PICH-GFP o Pich-DsRed), y el módulo de la integrasa (pICH14011) que codifica para una enzima que integra el 5 'y 3' módulos juntos tras la expresión ^8,15. También se necesitan tres construcciones de ADN para la expresión con vectores geminiviral. Además de los vectores que contienen el replicón del gen diana (pBYGFP o pBYDsRed), se requiere un vector que codifica para la proteína de replicación (pREP110) para la amplificación de la diana replicón ^11,14,16. Por otra parte, se desea la inclusión de un vector que codifica la p19 supresor de silenciamiento del virus del enanismo ramificado del tomate para la expresión del gen diana de alto nivel de ^11,16.

En general, existen tres pasos principales para la introducción de genes de proteínas recombinantes en células de plantas por agroinfiltration incluyendo el crecimiento de la planta, A. preparación de cultivo tumefaciens, y la infiltración. Se ofrece como cada paso es fundamental para el éxito final de este procedimiento, por lo tanto, una descripción detallada de cadatanto para la infiltración de jeringa y la infiltración al vacío a continuación.

Protocolo

1. Crecimiento de las Plantas

1. Lugar 60 pastillas de turba en una bandeja de propagación. Añadir 4 L de agua del grifo y dejar que la turba pellets de absorber el agua durante 2 horas.
2. Añadir 2 N. benthamiana semillas en cada una turba de pellets con una sembradora, cubrir la bandeja con una cúpula de plástico transparente, y les permiten germinar en un C Humedad ambiente 25 °, el 84% con un ciclo día / noche de 16/8 horas (Figura 1).
3. Retire el domo dos semanas después de la siembra, drenar el agua de la bandeja, y añadir 2 litros de fertilizante de Jack a una concentración de 1,48 g / L (Figura 1B). Continuar para cultivar plantas en un entorno C Humedad 25 °, el 50% con una hr día / noche ciclo de 16/8. Suministro 2 L de fertilizante de Jack cada 2 días a la bandeja.
4. En la semana 4, transferir las plantas con pellets de turba a una nueva bandeja que aloja seis plantas para proporcionar un espacio adecuado para un mayor crecimiento (Figura 1C) hasta que estén listos para ser infiltrado a las 6 semanas de edad (figura1D).

2. A. tumefaciens Cultura Preparación

2.1 Preparación para la infiltración Jeringa

1. Racha A. tumefaciens GV3101 cepas que contienen los vectores geminiviral p19, pREP110, pBYGFP, y pBYDsRed en placas de agar LB que contenían kanamicina (100 mg / ml). Racha de una cepa por placa y crecer a 30 º C durante 48 horas.
2. Del mismo modo, la raya y GV3101 crecer las cepas que albergan los vectores magnICON de la 5 'módulo (pICH15879), el 3' del módulo que contiene el gen diana de GFP o DsRed (Pich-GFP o Pich-DsRed), y la integrasa (pCH14011) en agar LB placas que contenían carbenicilina (100 mg / ml).
3. A partir de una sola colonia en la placa de agar LB, inocular GV3101 las cepas que albergan vectores geminiviral en 3 ml de YENB los medios de comunicación (0,75% de extracto de levadura Bacto, 0,8% Nutrient Broth, ajustar el pH a 7,5 con NaOH) + kanamicina (100 mg / ml) en un tubo de cultivo ml de fondo redondo de 15, crece el cultivo líquido a 30 ° C enun agitador durante la noche con una tasa de rotación de 300 rpm.
4. Del mismo modo, inocular GV3101 y crecer las cepas que albergan vectores magnICON en YENB medios + carbenicilina (100 mg / ml) durante la noche en un agitador a 30 ° C.
5. Los valores de medida y registro de DO ₆₀₀ para cada cultivo líquido con un espectrofotómetro y utilizar la siguiente fórmula para calcular el volumen necesario (V _sub) se subcultivaron para una nueva cultura con una OD de partida ₆₀₀ de 0.025 en 10 ml de medio YENB con los antibióticos apropiados .
   _Sub V (ml) = (10 ml) x (0.025) / OD ₆₀₀
6. Transferencia _sub V (ml) del cultivo de una noche a (10 - V _sub) ml de los medios de comunicación YENB con los antibióticos apropiados para cada cepa. Crecer el nuevo cultivo durante la noche a 30 ° C en un agitador con una velocidad de rotación de 250 rpm hasta que el valor de la DO ₆₀₀ está en el intervalo de 1,7-2,0.
7. Mida y registre OD ₆₀₀ valores para cada cultivo líquido y utilizar la fórmula siguiente para calcular el volumen necesario (V _inf) para ser diluido en 50 ml de tampón de infiltración para dar una _DO600 final de 0,12 para cada cepa.
   _Inf V (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD ₆₀₀
8. Transferencia _inf V (ml) de cada cultivo a un tubo de microcentrífuga y girar hacia abajo las células por centrifugación a 12.000 xg durante 2 min, a continuación, eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 10 ml de tampón de infiltración (MES 10 mM, pH 5,5; 10 mM MgSO ₄₎ por agitación con vórtex brevemente.
9. Mezclar resuspendieron las células de pBYGFP pREP110 + + p19, girar las células hacia abajo a 12.000 xg durante 2 min, y volver a suspender en total de 50 ml de tampón de infiltración. Esta combinación es agrobacterias para la expresión de GFP geminiviral.
10. Del mismo modo, mezclar las siguientes combinaciones de células de Agrobacteria, girar hacia abajo y volver a suspender en 50 ml de tampón de infiltración. Estos incluyen (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 para la expresión geminiviral de DsRed, (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 para geminiviral co-expresión de GFP y DsRed, (3) pREp110 + p19 como control negativo de la expresión geminiviral, (4) Pich-GFP + + pICH15879 pCH14011 magnICON para la expresión de GFP, (5) Pich-DsRed + + pICH15879 pCH14011 para la expresión magnICON de DsRed, y (6) pICH15879 + pCH14011 como control negativo para la expresión magnICON.

2.2 Preparación para la infiltración al vacío

1. Inocular y la cultura cada cepa GV3101 que contiene vectores geminiviral o vectores magnICON en 15 ml de medio de YENB con los antibióticos apropiados en un matraz de 50 ml y esterilizado en autoclave crecer durante la noche como se describe para la infiltración por encima de jeringa.
2. Los valores de medida y registro de DO ₆₀₀ para cada cultivo líquido con un espectrofotómetro y utilizar la siguiente fórmula para calcular el volumen necesario (V _sub) se subcultivaron para una nueva cultura con una OD de partida ₆₀₀ de 0.025 en 250 ml de medio YENB con los antibióticos apropiados .
   V _sub (Ml) = (250 ml) x (0.025) / OD ₆₀₀
3. Transferencia _sub V (ml) del cultivo de una noche a (250 - V _sub) ml de los medios de comunicación YENB en un matraz de 1 L autoclavado con los antibióticos apropiados para cada cepa y crecer el nuevo cultivo durante la noche como se describe para la infiltración por encima de jeringa.
4. Medir y registrar OD ₆₀₀ valores para cada cultivo líquido y utilizar la fórmula siguiente para calcular el volumen necesario (V _inf) para ser diluido en 3 L de tampón de infiltración para dar una _DO600 final de 0,12 para cada cepa.
   _Inf V (ml) = (3.000 ml) x (0.12) / OD ₆₀₀
5. Precipitado y se resuspende V _inf (ml) de cada cultivo en tampón de infiltración como se describe para la infiltración jeringa y mezclar las culturas resuspendidas de acuerdo con las combinaciones descritas para la infiltración jeringa. Repellet las células Agrobacteria mixtos y resuspender en 3 L de tampón de infiltración.

3. Infiltración

3.1 Jeringa infiltración

1. Elija cuatro de 6 semanas de edad N. benthamiana plantas con 5 hojas cada uno. Las tres primeras hojas, contando desde la parte superior de cada planta se infiltraron en su totalidad con una de las combinaciones de A. tumefaciens cepas en tampón de infiltración. La cuarta hoja será spot-infiltrada con todas las combinaciones de cuatro cepas de expresión geminiviral o las tres combinaciones de expresión magnICON. La última hoja de cada planta se infiltró con combinaciones de controles negativos.
2. Crear un pequeño corte con una aguja en la epidermis en el lado posterior de la hoja (Figura 2A). Atención: asegurarse de no rayar tan duro como para perforar la hoja a través de ambos lados, como las células de Agrobacteria en la mezcla de infiltración pasarán a través de la punción para el otro lado de la hoja.
3. Tome un firme control de la parte frontal de la hoja y mientras se aplica suavela presión en contra de la nick con el pulgar de una mano, se inyectan las mezclas de Agrobacterium en tampón de infiltración en el nick con una jeringa sin aguja (Figura 2B). Nota: Como la mezcla de Agrobacterium que entra en el espacio intercelular de la hoja, el área infiltrada se volverá verde visiblemente más oscuro (Figura 2C).
4. Continuar para inyectar las mezclas de Agrobacterium en el nick hasta que el círculo verde más oscuro deja de expandirse. Cree otro nick y repita los pasos 3.1.2-3.1.4 hasta que toda la hoja se infiltra y toda la hoja se vuelve verde más oscuro para las tres primeras hojas y la última hoja.
5. Para la cuarta hoja de cada planta, todas las combinaciones de cuatro (vector geminiviral) o tres (magnICON vector) se infiltraron en ella. Haga un nick para cada combinación de cepas de Agrobacterium, y se infiltran cada nick con una combinación.
6. Después de la infiltración, mover las plantas de nuevo a la sala de crecimiento y moniexpresión de la proteína mediador entre 2-15 días después de la infiltración (dpi).

3.2 Vacío infiltración

1. Coloque una bañera en un desecador de vacío y la transferencia de 3 l de tampón de infiltración que contiene las cepas de Agrobacterium a la bañera. Conectar el desecador a una bomba de vacío de diafragma de Vacuubrand (Figura 3A).
2. Coloque una planta boca abajo sobre la placa de desecador (Figura 3B) y bajar la placa con la planta hasta que todo el sistema de la hoja y tallo se sumergen en la memoria intermedia de la infiltración con la placa que descansa encima de la bañera. Coloque la junta tórica desecador a lo largo del borde y poner la tapa desecador de la cámara (Figura 3C).
3. Encienda la bomba de vacío y empezar a cronometrar cuando el vacío llega a 100 mbar. Abrir lentamente la válvula de descarga en el desecador después de 1 min a 100 mbar para permitir la entrada de Agrobacteria en los espacios intersticiales del tejido de la planta sumergida. Repita este paso uno addititiempo onal para asegurar una buena infiltración.
4. Después de la infiltración, tomar la planta del desecador y se puso de nuevo a su posición vertical. Mueva las plantas de nuevo a la cámara de crecimiento y expresión de proteínas de monitoreo entre 2-15 dpi.

4. Detección de la proteína fluorescente y fotografía

1. A partir de 2 dpi, las plantas se mueven en el cuarto oscuro y brillar la luz UV en el envés de las hojas infiltradas con una lámpara UV de mano.
2. Observar la fluorescencia verde de GFP o la fluorescencia roja DsRed. GFP emite una señal más fuerte con la luz ultravioleta de onda larga, mientras DsRed es más fuerte a la luz ultravioleta de onda corta.
3. Tome fotografías de hojas fluorescentes con una cámara digital normal sin flash.
4. Mueva las plantas de nuevo a la cámara de crecimiento después de la observación o la fotografía.

Resultados

1. Expresión de proteínas fluorescentes por infiltración Jeringa

Para demostrar la eficacia de la jeringa de la infiltración de Agrobacterium en el tejido de la planta, se probó la expresión de dos proteínas fluorescentes - GFP y DsRed - por dos vectores diferentes deconstruido de plantas virales - geminiviral y magnICON - en N. benthamiana. Por N. benthamiana hojas que fueron totalmente infiltrados con vectores que contienen geminiviral Agrobacteria, ...

Discusión

La creciente demanda de productos farmacéuticos basados ​​en proteínas en todo el mundo requieren de nuevas plataformas de producción que son robustas, escalables y de bajo costo y seguro. Las plantas han demostrado ser uno de los sistemas de producción alternativas más prometedoras para la producción de la proteína farmacéutica. En los últimos años, el desarrollo de vectores basados ​​en virus deconstruido ha permitido la expresión transitoria de proteínas en plantas, lo que mejora en gran medida la...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
GFP	Invitrogen	V353-20	www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008
DsRed	Clontech	632152	www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000
MagnICON Vector	Icon Genetics	n/a	www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006
Geminiviral Vector	Author's Lab	n/a	See reference: Chen and He, et al 2011
N. benthamiana	Author's Lab	n/a	herbalistics.com.au
Agrobacterium tumefaciens strain gv3101	Author's Lab	n/a	See reference: Lai and Chen 2012
LB Agar Carbenicillin-100, plates	Sigma	L0418	www.sigmaaldrich.com
LB Agar Kanamycin-50, plates	Sigma	L0543	www.sigmaaldrich.com
Magnesium sulfate hepa hydrate	Sigma	M2773-500 g	www.sigmaaldrich.com
Bacto-Tryptone	Fisher	73049-73-7	www.fishersci.com
Bacto Yeast Extract	Becton, Dickinson & CO.	REF 212750	www.bd.com
Difco Nutrient Broth	Becton, Dickinson & CO.	REF 234000	www.bd.com
MES hydrate Buffer	Sigma	M8250-1kg	www.sigmaaldrich.com
Carbenicillin	Sigma	C1613-1ML	www.sigmaaldrich.com
Kanamycin	Sigma	70560-51-9	www.sigmaaldrich.com
Sodium Hydroxide	Sigma	221465	www.sigmaaldrich.com
Jack's Fertilizer	Hummert International	Jul-25	www.hummert.com
			Equipment
Vacuubrand MD4 Vacuum Pump	Fisher	13-878-113	www.fishersci.com
Vacuum Air Regulator Valve	Fisher	NC9386590	www.fishersci.com
Desiccator 12 1/8" with O ring	Fisher	08-594-15C	www.fishersci.com
3 L Tub	Rubber-Maid	n/a	Rubbermaid Servn' Saver Bowl, 10-cup will work
plate/shelf 230ML	Fisher	NC9489269	www.fishersci.com
Peat Pellet	Hummert International	14-2370-1	www.hummert.com
Propagation Tray Dome	hydrofarm	132052	www.hydroponics.net
Propagaiton Tray	hydrofarm	138758	www.hydroponics.net
Virbo Hand Seeder	Gro-Mor INC	n/a	www.gro-morent.com
Flora Cart 4 shelf	Hummert International	65-6924-1	www.hummert.com
15 ml Round Bottom Culture Tubes	Sigma	CLS430172-500EA	http://www.sigmaaldrich.com
Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	www.bio-rad.com
Spectrophotometer Cuvettes	Bio-Rad	223-9950	www.bio-rad.com
Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1415-2500	www.usascientific.com
Benchtop Centrifuge	Bio-Rad	166-0602EDU	www.bio-rad.com
Incubator/Shaker	Eppendorf	Excella E25	www.eppendorf.com
Ultraviolet Light Model#: UVGL-25	UVP	95-0021-12	www.uvp.com