In-vivo-Imaging von Optic Nerve Fiber Integrität von Contrast-Enhanced MRI in Mäuse

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt ein Verfahren, mit einem klinischen 3 T Scanner, für kontrastverstärkte MR-Bildgebung des naiven Maus visuelle Projektion und für sich wiederholende und Längs in-vivo-Studien der Sehnerv-Degeneration mit akuter Sehnerven Quetschverletzung und chronische Degeneration des Sehnervs an assoziierten Knock-out-Mäusen (p50 ^KO).

Zusammenfassung

Das Nagetier visuelle System umfasst retinalen Ganglienzellen und ihre Axone, die den Sehnerv bilden Thalamus und im Mittelhirn Zentren und postsynaptischen Vorsprünge auf den visuellen Kortex ein. Auf der Grundlage seiner ausgeprägten anatomischen Struktur und bequeme Erreichbarkeit, hat es sich die bevorzugte Struktur für Studien über die neuronale Überleben, axonalen Regeneration und synaptische Plastizität. Jüngste Fortschritte in der MR-Bildgebung haben die in vivo Visualisierung des retino-tectalen Teil dieser Projektion mit Mangan-vermittelten Kontrastverbesserung (MEMRI) aktiviert. Hier präsentieren wir eine MEMRI-Protokoll für die Darstellung der visuellen Projektion in Mäusen, durch die Beschlüsse der (200 um) ³ lassen sich mit üblichen 3-Tesla-Scanner erreicht werden. Wir zeigen, wie intravitreale Injektion einer einzelnen Dosis von 15 nmol MnCl ₂ führt zu einer Verbesserung der gesättigten intakt Vorsprung innerhalb von 24 Stunden. Mit Ausnahme der Netzhaut, Änderungen in der Signalstärke sind unabdent von übereinstimm visuelle Stimulation oder physiologische Alterung. Haben wir weiter diese Technik anzuwenden längs überwachen axonalen Degeneration in Reaktion auf akute Verletzung des Sehnervs ein Paradigmen durch die Mn ^{2 +-Transport} vollständig Verhaftungen an der Verletzungsstelle. Umgekehrt ist aktiv Mn ^{2 +-Transport} quantitativ angemessenen Verhältnis zur Rentabilität, Anzahl und elektrische Aktivität der Axon-Fasern. Für eine solche Analyse, veranschaulichen wir Mn ^{2 +-Transport} Kinetik entlang der visuellen Pfad in einem transgenen Mausmodell (NF-kappaB p50 ^KO) Anzeige spontane Atrophie der sensorischen, visuelle, Projektionen. Bei diesen Mäusen zeigt MEMRI reduziert, sondern Mn ^{2 +-Transport} im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen nicht verzögert und zeugen somit Anzeichen für strukturelle und / oder funktionelle Beeinträchtigungen durch NF-kB-Mutationen.

Zusammenfassend MEMRI bequem überbrückt in vivo-Tests und Post-mortem-Histologie für die characterizatiauf der Nervenfaserintegrität und Aktivität. Es ist sehr nützlich für Längsschnittstudien zur axonalen Degeneration und Regeneration, und Untersuchungen von mutierten Mäusen für echte oder induzierbare Phänotypen.

Einleitung

Aufgrund seiner günstigen neuro-anatomische Struktur das Nagetier visuelle System bietet einzigartige Möglichkeiten, pharmakologische Verbindungen und deren Eignung zur Neuroprotektion ¹ oder pro-regenerative Wirkung ^2,3 vermitteln. Darüber hinaus ermöglicht es Studien über die funktionalen und neuroanatomischen Merkmale von Mausmutanten, wie kürzlich für die Mäuse, denen der präsynaptischen Gerüstprotein Bassoon ⁴ veranschaulicht. Ferner ist ein breites Spektrum von Zusatzwerkzeugen bietet zusätzliche mit der retinalen Ganglienzellen (RGC) und RGC-Axone Nummern RGC-Aktivität, z. B. durch Elektroretinographie und Verhaltenstests und der Bestimmung der kortikalen Umlagerungen durch optische Abbildung der intrinsischen Signalen. Die neuesten technischen Entwicklungen in der Laser-Mikroskopie ermöglicht die in situ-Visualisierung von RGC Regeneration durch tiefe Gewebe Fluoreszenz-Imaging in ganze Berg Exemplare der Sehnerv (ON) und Gehirn. In dieser histologischenschen Ansatz, Tetrahydrofuran basierte Gewebe Clearing in Kombination mit Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Auflösung von Einzelfasern, die in die deafferentierten ON und Tractus ⁵ erneut eingeben. Während solche Techniken vielleicht überlegen in der Auflösung und Bestimmung von Wachstumsmustern zu sein, haben sie nicht aktivieren wiederholende und Längsschnittanalysen der einzelnen Wachstums Ereignisse, die besonders erwünscht sind, den Prozess der langfristige Regeneration zu beurteilen.

Kontrastmittel-MRT ist für die minimal invasive Visualisierung der retino tectalen-Projektion bei Mäusen und Ratten ^6,7 eingesetzt. Dies kann durch direkte intraokulare Lieferung von paramagnetischen Ionen (z. B. Mn ^{2 +),} um Netzhautzellen erreicht werden. Als Calcium-analog, wird Mn ^{2 +} in RGC Somata über spannungsgesteuerte Calcium-Kanäle eingebaut und entlang der axonalen Zytoskeletts der intakten ON und Tractus aktiv transportiert. Während es in der Hirnkerne sammeltder visuellen Vorsprung, dh die Corpus geniculatum laterale (LGN) und Colliculus superior (SC), transsynaptische Ausbreitung in den primären visuellen Kortex erscheint vernachlässigbar ^8,9, obwohl es ^10,11 auftreten. Unter MR-Sequenzierung, paramagnetische Mn ^{2 +} steigert MR-Kontrast hauptsächlich durch Verkürzen _{T1-Spin-Gitter-Relaxationszeit} ^12. Solche Mn ^{2 +} MRT (MEMRI) ist erfolgreich in verschiedenen neuro-anatomische und funktionelle Untersuchungen von Ratten, wie die Bewertung des axonalen Regeneration und Degeneration nach ON Verletzungen ^13,14 angewendet, die genaue anatomische Zuordnung der retino-tectalen Vorsprung ¹⁵ sowie die Bestimmung des axonalen Transporteigenschaften nach pharmakologischen Behandlung ^16. Letzte Verfeinerungen in der Dosierung, Toxizität, und die Kinetik der neuronalen Mn ^{2 +-Aufnahme} und Transport, sowie verbesserte MRI-Protokolle seiner Anwendung auf Studien an transgenen verlängertMäuse ⁹ mit 3-Tesla-Scanner üblicherweise in der klinischen Praxis ¹⁷ verwendet.

Hier präsentieren wir eine MEMRI-Protokoll eignet sich für Längs-in-vivo-Bildgebung der Maus retino tectalen-Projektion und veranschaulichen ihre Anwendbarkeit durch die Beurteilung Mn ^{2 +-abhängige} Signalverstärkung unter naiv und Neurodegeneration verschiedenen Bedingungen. Unser Protokoll legt besondere Betonung auf der MR-Datenerfassung in einem moderaten 3 T Magnetfeld, die allgemein zugänglicher als engagierten Tier-Scanner. In naiven Mäusen veranschaulichen wir, wie Trakt spezifische Signalintensität erhöht werden, nach intravitrealer (ivit) Mn ^{2 +-Anwendung} deutlich und reproduzierbar zu werden. Quantitativ, Mn ^{2 +} Ausbreitung entlang der visuelle Projektion erfolgt unabhängig von den normalen Alterungsprozess (zwischen 3 und 26 Monate alten Mäusen gemessen) und Vergrößerung ist refraktär visuelle Stimulation und die Anpassung an Dunkelheit. Im Gegensatz dazu, Mn 2 +-Anreicherung in Mittelhirn und Thalamus-Zentren wird nach akuter ON Quetschverletzung ¹⁸ sowie in NFKB1 Knock-out-Mäusen (p50 ^KO) leiden spontane RGC apoptotischen Tod und ON-Degeneration ¹⁹ verringert. So wird in Erweiterung zu herkömmlichen histologischen Analyse Längs MEMRI Analyse der einzelnen Tiere ermöglicht Profilierung der einzigartigen Kinetik von neurodegenerativen Prozessen. Dies sollte nützlich für Studien zur Neuroprotektion und axonalen Regeneration mit pharmakologische oder genetische Eingriffe verbunden beweisen.

Protokoll

Alle Tier Eingriffe werden in Übereinstimmung mit der Europäischen Konvention zum Tierpflege und Verwendung von Labortieren und dem ARVO Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research durchgeführt. Alle Versuche werden von der lokalen Ethikkommission genehmigt. Das Verfahren von der Schädigung bei Mäusen anderswo ⁹ beschrieben.

1. Intravitreale Injektion Mangan

1. Führen Sie die Mn ^{2 +-Injektion} 24 Stunden vor der MR-Scan mit Hilfe eines Assistenten. Anesthetize die Tiere durch intraperitoneale Injektion einer 5% Chloralhydrat-Lösung (420-450 mg / kg Körpergewicht in sterile PBS). Weitere Lokalanästhesie, einen Tropfen Flüssigkeit conjuncain (0,4% Oxybuprocainhydrochlorid) auf die Hornhaut vor Augen Punktion. Um injizieren 15 nmol Mn ^{2 +} pro Auge bereiten eine 7,5 mM MnCl _2-Lösung, z. B. durch Verdünnen von 1 L 1 M _MnCl2 Stammlösung in 132 LH _{2 <}/ Sub> O. Last 5 ul der Endlösung in eine 5 ul-Hamilton-Spritze mit einem 34 G kleinen Hub abnehmbare Nadel (RN Nadel) verbunden ist.
2. Beim Start mit dem rechten Auge, positionieren Sie die Maus nach links seitig unter einem Binokular und sanft öffnen und fixieren das rechte Auge zwischen Daumen und Zeigefinger der linken Hand. Nehmen Sie die Spritze mit der rechten Hand und fassen Sie die Nadel in der Nähe der Spitze. Atraumatische Punktion des Augapfels, die Nadel vorsichtig in den Glaskörpereinsatz am infero-zeitlichen Umfang von etwa 1 mm distal des Limbus, dadurch Schonung skleralen Gefäße.
3. Als nächstes wendet der Assistent langsam das Gesamtvolumen von 2 ul, während die Skala des Hamilton-Spritze. Während dieses Vorgangs überwachen die optimale Platzierung der Nadel unter dem Mikroskop und Punktion der Linse oder Verschütten der Flüssigkeit zu vermeiden. Halten Sie die Nadel statisch für weitere 30 Sekunden eingefügt, dann langsam zurückziehen, um Flüssigkeit zu minimierenLeckage aus der Injektionsstelle.
4. Während des gesamten Verfahrens, sollte besondere Sorgfalt darauf verwendet werden, um Druck auf das Auge zu vermeiden. Ebenso vermeiden harsche oder zahlreiche Versuche, um das Auge Glühbirne durchstechen. Da Mn ^{2 +-Aufnahme} in RGZ und Transport entlang der ON ist bereits bei 15 nmol _MnCl2 gesättigten minimiert diese Signalschwankungen um etwas ungenau Injektionsvolumina. Für bilaterale Signalverstärkung der visuellen Projektion, wiederholen Sie den Einspritzvorgang für das linke Auge.
5. Gelten Ofloxacin enthaltenden (3 mg / ml) Augentropfen und Panthenol haltige Salbe einmal nach dem Verfahren, Augeninfektionen und Trocknen des Auges zu verhindern. Liefert die Mäuse in ihre Käfige unter normalen Wohnbedingungen bis zum Beginn der MR-Scan.

2. Vorbereitung der Tiere für die MRT

1. Betäuben die Maus durch die Verabreichung von 2% / 98% Isofluran / Sauerstoff-Gasgemisch. Montieren Sie die Maus auf eine Maushalterung in einem fast horizontal, aufgedreht Position. Insert es in den MR-Spule, die dann innerhalb des MR-Scanners angepasst. Überwachung der Atmung und der Herzfrequenz durch geeignete Systeme. Für technische Details siehe Herrmann et al ^20.
2. Während der MRT-, Liefer-Anästhesie durch kontinuierliche Insufflation einer zunächst 1,5% / 98,5% Isofluran / Sauerstoff-Gasgemisch über einen Verdampfer zur Maus Kopfhalter durch eine integrierte Rohr verbunden. Während der Abtastung nach der aufgezeichneten Vitalparameter (dh Ziel für eine stabile Atmungsrate von etwa 40 Atemzüge pro Minute) Einstellen der Tiefe der Anästhesie. Verwendung einer Heizvorrichtung halten den Körper Oberflächentemperatur stabil zwischen 35 und 37 ° C, wie durch einen Temperatursensor an der Bauchfalte des Maus positioniert gemessen. Für technische Details siehe Herrmann et al ^17.
3. Nach dem Scan, befreien Sie die Maus aus der Halterung und mit reinem Sauerstoff zu versorgen, um aus der Narkose zu beschleunigen. Darüber hinaus stabil zu halten, die Körpertemperatur durch die Verwendungein rotes Licht Wärmequelle.

3. MRT-Protokoll

1. Das Protokoll für ein 3-Tesla-Scanner mit einer dedizierten, SNR-effiziente, Kleintier Spule (linear polarisierten Litz Spule) ausgestattet mit einer effektiven Sichtfeld von 35 mm × 38 mm Durchmesser geprüft. Betreiben Sie die Spule in Sende-Empfangs-Modus.
2. Mit dem Tier in seiner endgültigen Position, stellen Sie die Melodie und Spiel der Spule mit Hilfe einer Frequenzanalyse. Manuelle Einstellung der Sender Referenzspannung und die Shimströme zu Bildhomogenität und Qualität zu optimieren.
3. Erwerben T ₁ gewichtet 2D-TSE-Bilder mit einer Auflösung von 0,5 mm × 0,5 mm × 2 mm in sagittaler und transversaler Ansicht für die Planung. Mit Hilfe der Planung MR-Scans, die MEMR Bilder in koronalen Messrichtung zu erwerben, gedreht parallel zum Kopf des Tieres mit Phasenkodierung entlang der Links-Rechts-Richtung sein. Um Erfassungszeit zu minimieren, verwenden eine rechteckige Sichtfeld, um die eingestelltetatsächlichen Kopfabmessungen. Verwenden Sie ein verwöhntes 3D FLASH-Sequenz (VIBE 3D) mit folgenden Parametern: Grundmatrix 256, Sichtfeld 54 mm x 50,65 mm x 14,08 mm, mit 93,8% rechteckigen Sichtfeld in Phasencodierrichtung und 128 Scheiben von 0,11-mm- Schichtdicke mit Scheibe Auflösung auf 61% festgelegt.
4. Aktivieren Sie die in-plane-Interpolation, um die endgültigen Bilder mit 512 × 480 × 128 schaffen, bietet eine effektive Auflösung von 0,21 mm x 0,21 mm x 0,18 mm (0,1 mm x 0,1 mm x 0,09 mm interpoliert), Echozeit T _E = 6,51 ms, Wiederholungszeit T _R = 16 ms, Bandbreite = 160 Hz / Pixel, Flip-Winkel = 22 °. Tragen Sie zwei Durchschnitte und drei Wiederholungen, um eine Gesamtaufnahmezeit (T _A) von ca. 30 min zu erreichen.

4. MRI Data Analysis

1. Analysieren Sie die Daten mit Hilfe der Software syngo Fastview. Für die quantitative Signalverstärkung, wählen definierten Regionen of Interesse planaren 2D-MRT-Aufnahmen und Signalintensitäten zu bestimmen (SI) der verstärkten Struktur (SI _MEMRI), Gewebehintergrund (SI _backgr) und der Standardabweichung des Rauschens (SD _N). Falls erforderlich, verwenden Sie eine Maus Hirnatlas zu neuro-anatomische Orientierung für LGN und SC Strukturen erleichtern. Berechnet den Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) nach der Formel:
2. CNR = (SI _MEMRI - SI _backgr) / _SD-N
3. Quantifizieren drei aufeinander folgenden Bilder für mittlere CNR Berechnung für jede Probe. In bilateral injizierten Tieren, analysieren jede Hemisphäre unabhängig.
4. Für Darstellung von horizontal, koronale und sagittale Bilder, berechnen multiplanare Rekonstruktionen aus dem Original-3D-MRI-Datensatzes. Diese bearbeiteten Bilder werden nicht für die quantitative Analyse empfohlen. Um animierte 3D-Rekonstruktionen (Maximum Intensity Projektionen, MIPs) der retino erstellenTectalen-Projektion, verwenden Sie eine Angiographie Post-Processing-Software-Modul.

5. Mn ^{2 +} Autometallographie (TIMM Färbung)

1. Timm Färbung von Mn ^{2 +} zurückzuführen Hirnstrukturen folgende MEMRI injizieren eine Dosis von 15-150 nmol Mn ^{2 +} ivit 24 Stunden vor der Bilderzeugung.
2. Nach der MR-Scan, durchströmen die Tiere mit 30 ml eiskaltem 0,325% Na ₂ S in PBS (pH 7,4). Präparieren Sie retinae und gefrier Proben in Gefrierschnitt.
3. Schneiden sequentiell, Äquatorial Abschnitte von 15 um Dicke auf einer Kryotom.
4. Führen TIMM Färbung ²¹ in Abwesenheit von Fixiermittel und nach Kryokonservierung Angenstein et al ^22.

6. Statistische Analyse

Führen Sie statistische Analysen unter Verwendung des Student-t-Test für Einzelvergleiche, gefolgt von Post-hoc-ANOVA. Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler dargestellt. Individuelle N Zahlenfür jedes Experiment angegeben. Ergebnisse Erreichen P ≤ 0,05 werden als statistisch signifikant (p ≤ 0,05, *: P ≤ 0,01, **: P ≤ 0,001, ***).

Ergebnisse

Die Fähigkeit dieser Abbildungstechnik, genau zu beurteilen, die Vitalität und Funktionalität des Bildprojektions beruht auf präzise Anwendung eines nicht-toxischen Dosierungs Mn ^{2 +} in den Glaskörper und seine Aufnahme durch RGCs. Diese wichtige Voraussetzung wird in Fig. 1, wobei die Schicht bestimmte Mn ^{2 +-Aufnahme} durch Autometallographie (TIMM Färbung) ²¹ gezeigt, getestet. Netzhautschnitte wurden bei 24 h nach ivit Anwendung von entweder 15 oder 150...

Diskussion

MEMRI des visuellen Systems erstreckt herkömmlichen neurobiologische Techniken zur Beurteilung der Funktionalität unter naiven und pathologischen Bedingungen. Neben der einzigartigen Einblick in die Integrität eines isolierten ZNS-Fasertraktes, können MEMRI leicht mit Verhaltenstests, z. B., Optometrie und visuell basierte Wasser Aufgaben ergänzt werden, um die unmittelbaren Folgen eines bestimmten Paradigma für die visuelle Wahrnehmung zu untersuchen. Es verbindet auch elektrophysiologische und histologi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908