Mapping basato AFM delle proprietà elastiche delle pareti cellulari: al Tissue, cellulare, e le risoluzioni subcellulari

Riepilogo

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Abstract

Descriviamo un metodo recentemente sviluppato per misurare le proprietà meccaniche delle superfici dei tessuti vegetali utilizzando microscopia a forza atomica (AFM) micro / nano-rientranze per un JPK AFM. In particolare, in questo protocollo misuriamo modulo apparente di Young delle pareti cellulari con risoluzione subcellulare in tutte le regioni fino a 100 micron x 100 micron di meristemi floreali, ipocotili e radici. Questo richiede un'attenta preparazione del campione, la corretta selezione di micro-penetratori e profondità di rientro. Per spiegare le proprietà della parete cellulare solo, le misurazioni vengono eseguite in soluzioni altamente concentrate di mannitolo per plasmolyze le cellule e rimuovere il contributo del turgore cellulare circoscritta.

A differenza di altre tecniche esistenti, utilizzando diversi penetratori e profondità di rientro, questo metodo consente misurazioni multiscala simultanea, Tuttavia, diverse limitazioni restano: il metodo può essere usato solo abbastanza piccoli campioni (circa 100 micron di diametro) e solo su tessuti esterni; il metodo è sensibile alla topografia tessuto; misura solo alcuni aspetti del complesso proprietà meccaniche del tessuto. La tecnica è stata sviluppata rapidamente ed è probabile che la maggior parte di queste limitazioni saranno risolti nel prossimo futuro.

Introduzione

Crescita nelle piante è ottenuta dall'espansione coordinata delle pareti cellulari rigide che circondano ogni cellula dell'organismo. Accumulando prove indicano che è attraverso la modifica della chimica parete cellulare che le piante controllano localmente questa espansione. L'espansione è pensato per essere determinata principalmente da sforzo sulle pareti cellulari, causate da alta pressione turgore della cellula; questa risposta ceppo di turgore è regolato dalle proprietà meccaniche delle pareti cellulari ^1. Si sa poco di queste proprietà meccaniche e come cambiano durante lo sviluppo. Inoltre si sa poco di come queste proprietà meccaniche sono controllate e se le risposte contribuiscono ad alterare la chimica della parete cellulare in un modo che è apparentemente coordinata tra un tessuto. Se vogliamo comprendere la connessione tra cambiamenti chimici e meccanici nelle pareti cellulari delle piante durante lo sviluppo, e in ultima analisi come queste interazioni microscopiche governare una piantaÈ necessario s 'crescita macroscopica, un metodo che può monitorare le proprietà meccaniche di pareti cellulari nello sviluppo organi a scala cellulare o tessutale.

Il metodo di microscopia a forza atomica (AFM) qui descritto, che si basa su micrometriche o nanometriche compressioni tessuto o rientranze, è stato sviluppato proprio per misurare le proprietà meccaniche delle pareti cellulari nello sviluppo organi contemporaneamente a risoluzioni subcellulari e attraverso intere regioni di tessuto. Altri metodi hanno o una risoluzione che è troppo basso o troppo alto: l'estensimetro è solo in grado di misurare le proprietà medie meccaniche di un intero tessuto alla scala millimetrica ^2-4, una scala che è ad esempio troppo grande per misurare eventi precoci organogenesi; il microindenter può prendere misure a risoluzione subcellulare su scala nanometrica, ma si è limitato a misurare cellule isolate e non gruppi di cellule o organi ^5-7. Con l'AFM, l'richiedonod tessuto, cellulare, e risoluzioni subcellulari possono essere raggiunti ^8-10. Recentemente diversi protocolli sono stati sviluppati specificamente per misurare meccanica di piante tessuto che potrebbero anche essere utilizzati ^{11, 12.}

Nel seguito verrà illustrato come valutare l'elasticità del tessuto attraverso la misurazione della apparente modulo di Young ^13.

Il modulo di Young è comunemente usato per descrivere la rigidità di un materiale. Durante piccola deformazione la forza necessaria per deformare un materiale è proporzionale all'area di rientro. Il modulo di Young è tale coefficiente. Nel caso di un materiale omogeneo continua lo stesso coefficiente sarà misurato indipendentemente dal tipo rientranza (dimensioni e forma) ma cambia con la velocità della misurazione. Nel caso della struttura complessa di piante tessuto, abbiamo osservato finora che la forza è proporzionale alla deformazione permettendo la determinazioneun coefficiente di proporzionalità che chiamiamo "giovani modulo apparente". In contrasto da continue medias nelle piante, questa apparente modulo di Young è sensibile alla dimensione della rientranza. Non corrisponde alla giovane moduli di una parete cellulare puro. Esso descrive meglio l'elasticità del ponteggio della parete cellulare del tessuto.

Protocollo

1. Preparare vetrini in vetro per il campione di montaggio

1. Preparare imbedding mezzi di agarosio: 0,7% agarosio low melting nel 10% mannitolo (in acqua).
2. Utilizzando uno strumento metallico forte (ad esempio punta trapano, calce), etch su un'area cm 0.5 x 0.5 nel centro di un vetrino al microscopio. O invece, incollare un piccolo pezzo di lamelle di vetro (circa 20 x 200 micron) per vetrino con colla Araldite. NOTA: Questo irruvidisce la superficie per favorire l'adesione del agarosio per garantire che i bastoni multimediali agarosio o correzioni alla diapositiva. Questa diapositiva può essere riutilizzato.
3. Posizionare una goccia di circa 20 ml di imbedding supporti agarosio sulla regione incisa del vetrino. Questo dà una sottile pellicola di agarosio.
4. Conservare il vetrino in una scatola di umido e attendere per i media agarosio solidificare.

2. Dissezione e montaggio meristema Campioni

1. Meristemi Microdissect per l'immaginario confocaleng: togliere le gemme floreali uno per uno dallo stelo tirando giù con le pinzette ultrafini. È importante rimuovere tutte le gemme floreali fino alle papille che non presentano sepali (ossia la primordi P1 ^14).
2. Utilizzando una lama di rasoio o la punta delle pinzette, tagliare il meristema lontano dallo stelo. Il taglio deve essere parallelo alla regione della superficie meristema che deve essere misurato con l'AFM. L'apice ottenuto deve essere compresa tra 300 micron e 600 micron alto per adattarsi sotto la punta AFM.
3. Spingere l'apice nel film dei media agarosio preparati nella fase 1.1.4. Scegliere una posizione sul vetrino / agarosio e spingere delicatamente tale che il meristema sia direttamente a contatto con il vetrino e sporge fuori dal agarosio. E 'fondamentale per posizionare il meristema nella agarosio entro pochi secondi che seguono il suo taglio dallo stelo. NOTA: Questo è per impedire il meristema secchi. In questa fase, il meristema sarà in piedi in un crack perché l'agarosio fratturato in seguito all'applicazione di pressione.
4. Preparare diverse meristemi questo modo per l'imaging batch, fornendo che sono della stessa altezza e sono posizionati a meno di 500 pm l'uno dall'altro sulla diapositiva. Tenere i meristemi preparati nella casella umida mentre dissezione ulteriori campioni.
   NOTA: Esso limita la variazione proveniente dalla taratura. Idealmente 2 campioni di ogni condizione possono essere preparati e misurati in modo casuale. Finora non vi è alcun effetto osservato di immagini in batch sulla misura (stress indotto risposta). Questo potrebbe essere grazie alla diluizione di molecole di stress segnalazione in agar e / o la soluzione di montaggio. In alternativa la risposta allo stress è lo stesso indipendentemente alla quantità di campione preparato.
5. Prima di passare alla fase successiva, accertarsi che il confine tra il meristema e le gemme floreali è asciutto. In caso contrario, rimuovere delicatamente l'acqua in eccesso con carta da filtro. Ciò dovrebbe evitare che nella fase successiva che il fusoagarosio inonda il campione a causa di forze capillarità.
6. Con una pipetta 20 ml, aggiungere abbastanza sciolto il montaggio agarosio per riempire la fessura creata al punto 1.2.3. e per circondare ogni meristema. L'agarosio deve raggiungere il livello della cicatrice del bocciolo rimosso (primordio). Per ottenere ciò, può essere necessario aggiungere agarosio a ciascuna estremità della fessura.
7. Quando si aggiunge l'agarosio, che invaderanno rapidamente nella fessura; con la pipetta, succhiare parte di montaggio agarosio per garantire che il meristema è il punto più alto sulla diapositiva del fuso. Questo risolve il meristema in modo che non possa muoversi durante l'imaging.

3. Montaggio di radici o hypocotyl Campioni

1. Per radici e ipocotili, dissezione è necessario. Nel film sottile di agarosio sul vetrino preparato, fare una scanalatura direttamente sopra un etch in vetro o lungo una lamella di vetro. Posizionare la radice o hypocotyl in questa scanalatura assicurando che sia in contatto con l'vetro su tutta la sua lunghezza.
2. Prima di passare alla fase successiva, accertarsi che il campione è secco sulla sua superficie. In caso contrario, rimuovere delicatamente l'eccesso di acqua con carta da filtro.
3. Aggiungi sciolto il montaggio agarosio intorno al campione, come nel passaggio 1.2.6.

4. AFM preparazione e sensibilità di calibrazione (per un JPK Nanowizard AFM)

1. Montare una mensola sul AFM. Il cantilever deve essere montata con penetratore di forma rotonda. Il raggio determinerà la x, y, z la risoluzione e la profondità di penetrazione a cui misurazione accurata potrebbe essere archiviata.
   1. Per effettuare misurazioni meso-scala nanometrica sulla superficie della epidermide, utilizzare un penetratore rotonda raggio di 50 nm; di prendere le misure mesoscala, utilizzare un 0,5 micron raggio penetratore turno; di prendere le misure microscala (tutti 2-3 celle), utilizzare un penetratore rotonda 2,5 micron raggio.
2. Posizionare il laser sulla punta del cantilever. Allineare il laser al centrodel catturatore utilizzando lo specchio.
3. Posizionare un bicchiere pulito sotto l'AFM.
   NOTA: il seguente è destinata a trasformare il segnale di posizione laser sul recettore AFM in una deformazione del cantilever e, valutando la costante elastica del cantilever, per tradurlo in una forza.
4. Approccio con una forza target "set point" di 1 V.
5. Selezionare "spettroscopia di forza". Effettuare una rientranza impostando la massima "set point relativo" a 2 V, il "estendere velocità" a 40 pm / sec, e la "lunghezza z" a 5 micron.
6. Dal menu "Calibrazione manager", selezionare la parte lineare della curva forward per adattarsi alla sensibilità utilizzando il tasto "select gamma adatta". Il "set point relativo" dovrebbe essere trasformata da "volt" a "meter".
7. Dal menu "direttore calibrazione", selezionare "costante elastica" per valutare l'elasticity del cantilever usando fluttuazioni termiche. Premere "run" per ottenere la trama densità spettrale del cantilever. Trova il picco di risonanza con la frequenza più bassa. Montare utilizzando il tasto "select gamma adatta".
   NOTA 1: Per maggiori dettagli sulla messa a punto fluttuazioni termiche, leggi Cook et al ^15.
   Nota 2: E 'preferibile utilizzare un metodo diretto per valutare l'elasticità del cantilever utilizzando un cantilever di riferimento (o materiale con rigidità noto). Quello usato qui è stato gentilmente donato da Atef Asnacios ^16.
8. Aggiungere 200 ml di soluzione di mannitolo al 10% sotto la punta cantilever. Riallineare il laser per mezzo della catturatore utilizzando lo specchio.
9. Ricalibrare la sensibilità: dal menu "taratura manager", fare clic sul pulsante "sconosciuto"; ripetere i passaggi da 2.3 fino alla 2.5.

. 5 Acquisizione Dati: apparente Modulo di Young Cartografia

1. Posizionare i campioni montati sotto la AFM e aggiungere una goccia di 500 ml di soluzione di mannitolo al 10% sul campione. La soluzione di mannitolo plasmolyzes le cellule in pochi minuti.
2. Approccio con una forza di destinazione ("set point"), del 20 nN ("set point" non deve essere superiore a 3 V)
3. Rientro con un "set point parente" di 200 nN, una "estendere velocità" di 40 micron / sec, e "la lunghezza z" di 5 micron.
4. Regolare il "set point relativo" al fine di ottenere un rientro di 100 nm per il 200 nm montato a sbalzo o 0,5 micron per il 1 micron / 5 micron fissata a sbalzo.
5. In modalità "forza mapping", selezionare una regione per la scansione: per meristemi, 70 micron x 70 micron con una risoluzione ("pixel") di 64 x 64; per ipocotili e radici, 100 micron x 100 micron con una risoluzione di 64 x 64.
6. Premere SCAN per avviare gli esperimenti. Salvare l'output.

. 6 Analisi dei dati: Calcoli apparente modulo di Young

1. Aprire il file di dati nel software di analisi dati.
2. Seleziona "elaborazione batch" per applicare la stessa analisi di tutte le curve di una singola mappa.
3. Seleziona "correggere l'altezza per la piegatura del cantilever" in modo da estrarre la profondità di penetrazione.
4. Seleziona "modulo funzione in forma di Young" che assume la forza è proporzionale all'area di rientro. Impostare la "forma di punta" per parabolici per supporre che la forma rientro è una parabolica.
5. Indicare il raggio della punta.
6. Selezionare preferenzialmente la curva "ritrazione" per l'analisi perché è meno sensibile alla topografia rispetto alla curva "estendere". Tuttavia, se vi è una significativa incollaggio della sonda durante il "ritrazione" usare la curva "estendere", che è insensibile ad attaccare.
7. Setil rapporto di Poisson di 0,5. Premere analizzare e salvare l'output.

Risultati

Nella figura 1 presentiamo tipici Giovani mappe di moduli di meristemi floreali (Figure 1A e 1B), giovani e vecchi ipocotili (Figure 1C-F), e meristema root (Figura 1G e 1H). In tutti gli esperimenti penetratore è emisferico, ma il suo raggio si differenzia in modo che le diverse risoluzioni spaziali possono essere raggiunti figure 1C e 1D mostrano risultati tipici per penetratori meso...

Discussione

Nelle piante, la modifica delle proprietà meccaniche svolgono un ruolo importante nel dirigere la crescita e la morfogenesi. Ad oggi ci sono stati grandi progressi nel chiarire le reti genetiche e chimiche che controllano la crescita delle piante, ma la nostra conoscenza di come queste reti contribuiscono e sono influenzati dalle variazioni delle proprietà meccaniche è rudimentale. Questo metodo ci dovrebbe consentire di colmare questa lacuna, e quindi dovrebbe essere di forte interesse per gli scienziati che studian...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM	JPK	NanoWizard	All the 3-generation are able to do the work with the same preferment.
AFM stage	JPK	CellHesion	Required for sample with low topography (less than 11 µm between the lowest and the highest point in the area of force scanning).
AFM optics	JPK	Top View Optics	Very important in order to position the sample. Could be replaced by long range binoculars or a microscope.
Stereo microscope	Leica	M125	Any type of stereo microscope could do.
150 nm mounted cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	R150-NCL-10	To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use.
1 µm mounted cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	SD-Sphere-NCH-S-10	To measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis.
Tipless cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	TL-NCH-20	To measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5 µm mounted cantilever. We attached a 5 µm borosilicate bead to a tipless cantilever.
5 µm silicon microspheres	Corpuscular	C-SIO-5
Araldite	Bartik S.A. 77170 Coubet, France		Araldite for fixing the bead to the tipless cantilever.
Low melting agarose	Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410	BP160-100	34-45 °C gelation temperature
D-Mannitol	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA	M4125-500G
2 Stainless Steel No. 5 Tweezers	Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland	951199