In Vivo L'électroporation et microinjection de testicule de souris

Résumé

Cet article décrit la micro-injection et l'électroporation de testicule de souris in vivo en tant que technique de transfection de cellules testiculaires de souris pour étudier les procédés uniques de la spermatogenèse. Le protocole présenté implique des étapes de préparation capillaire en verre, la micro-injection par le conduit efférent, et la transfection par électroporation.

Résumé

Cette vidéo et l'article contribution donne une description complète de micro-injection et l'électroporation des testicules de souris in vivo. Cette technique de transfection particulier pour les cellules testiculaires de souris permet l'étude des processus uniques de la spermatogenèse.

Le protocole qui suit se concentre sur la transfection de cellules testiculaires de souris avec des constructions plasmidiques. Plus précisément, nous avons utilisé le vecteur rapporteur pEGFP-C1, qui exprime renforcée protéine fluorescente verte (eGFP) et aussi le vecteur pDsRed2-N1 exprimant la protéine fluorescente rouge (DsRed2). Les deux gènes rapporteurs codés étaient sous le contrôle du promoteur du cytomegalovirus humain précoce immédiat (CMV).

Pour effectuer un transfert de gène dans les testicules de souris, les constructions de plasmides rapporteur sont injectés dans les testicules de souris vivantes. À cette fin, les testicules d'un animal anesthésié est exposé et le site de micro-injection est préparée. Notre lieu privilégié deinjection est conduit efférent, avec le rete testis finalement connecté en tant que voie de transport anatomique des spermatozoïdes entre le testicule et l'épididyme. De cette manière, le remplissage des tubes séminifères après la micro-injection est très bien gérée et contrôlée grâce à l'utilisation de solutions d'ADN colorées. Après avoir observé un remplissage suffisant du testicule par sa structure de tube de couleur, l'organe est soumis à une électroporation. Ceci permet le transfert de la solution d'ADN dans les cellules testiculaires. À la suite de 3 jours d'incubation, le testicule est enlevé et étudiée au microscope à fluorescence verte ou rouge, ce qui illustre le succès de la transfection.

Généralement, ce protocole peut être utilisé pour fournir l'ADN ou l'ARN construit dans les testicules de souris vivante pour (sur) exprimer ou abattre des gènes, ce qui facilite l'analyse de la fonction des gènes in vivo. En outre, il est adapté pour l'étude de constructions rapporteurs ou règlements de gène putatiféléments conservateurs. Ainsi, les principaux avantages de la technique d'électroporation sont des performances rapides en combinaison avec peu d'effort ainsi que l'équipement technique modérée et les compétences requises par rapport à d'autres techniques.

Introduction

Spermatogenèse chez les mammifères est considérée comme un processus complexe de cellules souches auto-renouvelables subissant successivement la mitose, la méiose et de la différenciation, afin de développer dans les spermatozoïdes matures haploïde. Ces changements morphologiques sont orchestrées par différents types de cellules et malgré les tentatives profondes, il est encore impossible d'imiter ces procédés en culture cellulaire ^1,2. Par conséquent, la recherche sur la spermatogenèse jusqu'à maintenant s'appuie sur les organismes vivants comme des modèles in vivo. En général, les études de la fonction des gènes sont généralement basées sur les animaux transgéniques. Toutefois, la génération et le maintien de ce type de modèle animal est long, coûteux et très élaboré. Ceci est attribué au processus de sélection de temps nécessaire pour générer et maintenir le transgène au cours des générations. En outre, la manipulation génétique de l'organisme tout entier par l'approche transgénique ou knock-out est sujette à provoquer des déficiences physiologiques lors du ciblage gènes avec des fonctions essentielles dans plusieurs régions, par exemple, en dehors du testicule ou systémique.

En outre, certaines méthodes de transfection transitoire sont associés à des inconvénients cruciaux. Par exemple, les inconvénients typiques de transfert de gène à médiation virale sont la provocation possible de réactions immunologiques et des règlements de sécurité supplémentaires, tandis que la lipofection ³ et ⁴ bombardement de microparticules peut endommager les tissus et sont limités à une certaine profondeur de la cellule pour l'efficacité de la transfection suffisante.

En revanche, l'électroporation (EP) comme une autre façon commune de transfection transitoire, semble constituer une technique prometteuse pour permettre à la transfection in vivo et in vivo une analyse cohérente de gène. En général, les PE est désigné comme un phénomène dynamique qui dépend de la tension transmembranaire locale avec des pores au sein médiées par conséquent nanosecondes. Ces écarts peuvent être maintenus pendant millisecondes, suffisant to accorder l'accès à l'ADN, de l'ARN ou des petites molécules ^5. Lorsque la tension appliquée est trop élevée, le caractère généralement transitoire de PE est compensée en raison de la production de chaleur et de perméabilisation induction trop étendu avec en conséquence des dommages irréversibles de la cellule ^5.

Ici, nous montrons que l'électroporation est un système de transfection efficace et économique, qui est capable d'être utilisé pour la transformation génétique du testicule afin d'élucider les caractéristiques de gène in vivo sur les testicules. Cet article traite de la préparation de plasmides, la micro-injection par le conduit efférent et l'électroporation ultérieure de testicule de souris. Cette procédure peut être le moyen de choix pour atteindre transfection rapide, spécifique et efficace des tubes séminifères des testicules de souris in vivo afin d'étudier les processus de la spermatogenèse.

Protocole

Toutes les expériences pratiquées sur les animaux ont été approuvés par le comité d'éthique local (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Allemagne).

Préparation 1 Le plasmide

1. Pour la préparation de plasmides, en utilisant des kits de purification de plasmide (voir le tableau des matériaux) ou des procédés similaires avec du tampon d'élimination de l'endotoxine de sorte que les réactions immunitaires de l'animal peuvent être évités. Suivez les instructions du manuel. Employer le trou DDH ₂ O pour diluer la solution de plasmide.
2. Eliminer les débris par filage de la solution d'ADN à la vitesse maximale (20 000 xg). Ramassez ensuite le surnageant.
3. Déterminer la concentration de plasmide avec un spectrophotomètre (voir matériaux).
4. Ajuster la concentration de plasmide avec le trou DDH ₂ O à 1-3 mg (ADN) / pl. Remarque: Des concentrations plus faibles réduisent l'efficacité de la transfection, tandis que des concentrations plus élevées peuvent causer une solution d'injection trop visqueux. En outre, leefficacité de la transfection dépend de la taille du plasmide et doit être testé individuellement.
5. Avant l'injection, préparer un mélange de la solution avec 40 ul par exemple plasmide avec 5 ul de PBS (10x) et 5 ul vert Fast (0,5%). Fast Green est nécessaire pour suivre le processus d'injection. De préférence, utiliser murales PCR tubes minces ou parafilm. Remarque: En fonction de la taille des testicules, un volume de 20-50 ul sera nécessaire pour chaque testicule.

2 Préparation de microinjection Pipette

1. Utilisez capillaires de borosilicate (voir le tableau des matériaux) pour préparer les pipettes de micro-injection.
2. Tirez capillaires en verre avec un extracteur capillaire vertical (voir le tableau des matériaux).
3. Casser l'embout capillaire avec une pince par baguage doucement. La pointe est habituellement de 50-80 m de diamètre et d'environ 1 cm de long. Essayez d'éviter les trucs trop longtemps que ceux-ci ne sont pas suffisamment rigide pour pénétrer dans le tissu.
4. Enfin, sharpen la pointe dans un 30 ° à 45 ° en utilisant un chanfreiner micropipette (voir le tableau des matériaux).
5. Charger la pipette de micro-injection avec le mélange de solution d'injection (voir la préparation de plasmide). Appliquer la solution à l'arrière du capillaire de verre avec une petite seringue. Remarque: Essayez d'éviter les bulles d'air pendant le chargement, sinon ceux-ci seront injectés dans les tubes séminifères avec la solution de plasmide et donc permettra de réduire la conductivité ainsi que, éventuellement endommager les tissus.

3. anesthésie et de chirurgie

1. Effectuer l'opération dans des conditions aseptiques en utilisant du matériel stérile (c'est à dire, seringue, aiguille, instruments chirurgicaux, etc). Cela permettra de réduire l'infection de l'animal et assurer un bon taux de survie.
2. Utilisez la souris mâle pour l'électroporation à l'âge de 6-8 semaines.
3. Pour initialiser un traitement analgésique postopératoire, fournir la souris avec des analgésiques ajouté de l'eau potable le jour avant la chirurgie. Ce culUres une analgésie préventive en cas de hypodipsia postopératoire hautement probable (de la consommation d'eau a diminué). A cet effet, exposer à de l'eau potable, par exemple une suspension d'ibuprofène pédiatrique (20 mg / ml). L'eau de boisson médicamenteuse doit également être fourni le jour un et deux de la reprise en concentration identique. Cela signifie une dose journalière de 7,5 mg / kg, valable pour poids de 25 g âgés de 8 semaines C57BL / 6J 5 ml / j d'eau potable et le corps. Ce schéma analgésique garantit un soulagement de la douleur fondamentale et récupération accélérée avec bien-être élevé ^26.
4. Pour la préparation de l'anesthésie solution sur le jour de la chirurgie de travail, mélanger 10% kétamine et xylazine 2% dans un rapport 1: 1 (voir le tableau des matériaux).
5. Pour anesthésier l'animal, appliquer 0,25 ml / 100 mg de poids corporel de manière sous-cutanée de la solution anesthésique (Kétamine = 0,125 g / kg; xylazine = 0,025 g / kg). Utilisez un site d'injection entre pelvienne et des membres afin d'éviter des dommages aux organes et les blessures de la souris. Habituellement, 10 min sont nécessairesjusqu'à ce que la souris est profondément anesthésié.
6. Couvrir les yeux de souris avec une pommade vétérinaire pour prévenir la sécheresse pendant l'anesthésie.
7. Testez arrestation anesthésie profonde, qui est perceptible par une absence totale de réponse. A cet effet, il suffit de pincer le bout de l'animal.
8. Pour démarrer l'opération, enlever les poils abdominale avec un rasoir électrique ou similaire et désinfecter la zone de coopération avec sterilium ou similaire.
9. Faire une incision ventrale directement au-dessus des glandes préputiales dans le centre de la région abdominale. A cet endroit, tirez d'abord la peau loin et mener une petite incision cutanée transversale d'environ 8-14 mm. Ensuite, continuer le long de la couche musculaire abdominale.
   Remarque: La lésion doit être aussi faible que possible pour réduire les méfaits de l'animal.
10. Tirez vers le haut les coussinet adipeux abdominal soin d'exposer les testicules ci-joint et le placer sur une feuille de papier jetable étanche drap préparé avant juste à côté du site de l'incision (figure 2A).
11. Utilisez des jumelles à find conduit efférent en tant que cible d'injection. La persistance du canal efférent est identifié comme la jonction de beau navire entre le testicule et l'épididyme. Il est situé à proximité de l'artère testiculaire important. La persistance du canal fonctionne presque à un angle de 45 ° par rapport à l'artère et visiblement entre l'épididyme habitant. Remarque: En fonction de l'âge de la souris, le canal artériel est habituellement enterré dans les tissus gras.
12. Utiliser des pinces fines pour dégager le conduit efférent de ce tissu adipeux. Après cela, placez le canal artériel publié sur une bande de papier stérile pour assurer la visibilité de la conduite sans nuire environnement.

La micro-injection d'ADN et 4 application

1. Raccorder la pipette de micro-injection, qui est chargé avec la solution de plasmide à l'unité micromanipulateur / injecteur.
2. Placez l'aiguille de microinjection parallèle au canal efférent avec la pointe dirigée vers le rete testis (figure 2B).
3. Utilisez des pinces fines etdépouiller le conduit sur la pipette de micro-injection. Assurez-vous que le capillaire est maintenue parallèle à la conduite tout en tirant sur.
   Remarque: Cette procédure est plus pratique que pénétrer dans le navire en déplaçant l'aiguille avec le micromanipulateur.
4. Dirigez l'aiguille délicatement vers le testicule et arrêter tout comme il pénètre dans le rete testis directement sous l'albuginée (figure 2C).
   Remarque: Dans le cas de trop loin le rete testis, la solution de plasmide fuite dans l'espace interstitiel. Cela conduit souvent à l'échec de la transfection des tubes séminifères.
5. Pour l'injection de la solution de plasmide d'utiliser le micro-injecteur ayant les paramètres suivants: pi: 100 hPa, Ti: 0,2 sec, et pc: 0 hPa (figure 2D).
6. Surveiller le processus d'injection ensemble en observant le testicule état de remplissage à l'aide de la couleur verte. Veillez à ce que le testicule est seulement rempli jusqu'au 2/3 de son volume avec le plsolution asmid (figure 2E).
   Remarque: Si le volume d'injection est dépassée, le tissu testiculaire pourrait en être affectée.

5. électroporation de testicule

1. Pour activer l'électroporation efficace, faire tremper les électrodes de pincement dans du PBS (1x). Cela garantit conductance adéquate.
2. Douceur serrer les testicules entre les électrodes humides (figure 2F). Mesurer la résistance électrique avec la électroporateur.
3. Appliquer un courant au testicule. Effectuer huit impulsions carrées de 40 V à 4 sites différents testicules avec une durée constante de 50 temps d'impulsion ms et 950 ms de temps d'intervalle.

6. fermeture de la plaie et post-chirurgie

1. Lorsque l'électroporation est terminé, placez le testicule de retour dans l'emplacement d'origine.
2. Coudre la couche musculaire interne avec une suture chirurgicale (voir matériaux).
3. Fermez la peau en utilisant des agrafes (voir le tableau des matériaux). Tirez la peau jusqu'à l'esprith pincettes. Assurez-vous d'exclure la couche musculaire. Placer les agrafes, chacune à une distance d'au plus 5 mm.
   Remarque: En raison suture chirurgicale peut être avalé par la souris, des agrafes sont favorisés pour la fermeture de la lésion de la peau.
4. Laissez la souris pour récupérer de l'anesthésie sur des serviettes en papier stériles placées dans une cage de la souris vide stérile, qui est tempéré sur un bloc chaud 37 ° C. Le tampon doit assurer le réchauffement de la moitié de la cage de créer un gradient thermique. Pour l'animal ce fait possible de rechercher la zone individu, plus confortable du fait de la variété de la température dans la cage. En outre, couvrir la souris avec une feuille de papier essuie stérile afin que le stress peut être encore réduit. Remarque: Depuis la surface du corps de la souris est peu commune par rapport à la masse, par rapport à des animaux plus gros, le support thermique est d'une importance particulière pour la récupération réussie de rongeurs.
5. Lorsque l'animal opéré a pleinement éveillé, transférer it pour poursuite de la reprise à une nouvelle cage de la souris entièrement équipée. Ne pas mettre l'animal à son ancienne cage ou à un groupe de souris. Assurez-vous que la cage est aussi propre et stérile que possible pour prévenir l'infection de la plaie. Surveiller le processus de récupération. Pour transférer de la souris vers l'établissement de soins des animaux, attendre jusqu'à ce qu'il ait totalement récupéré et semble se comporter normalement.
   Remarque: personne supplémentaire et les stratégies post-chirurgicales sont discutées par Pritchett-Corning KR et al ^6.

Résultats

Le cadre expérimental pour réaliser une micro-injection et l'électroporation des testicules de souris in vivo tel qu'il est utilisé selon le protocole est illustré à la figure 1. Même si il est possible d'acquérir micropipettes fabriqués industriellement, nous avons préféré pour générer nos propres pipettes en tirant (figure 1A ) et le biseautage (figure 1B) des capillaires en verre de sorte que qu'ils équipés nos besoin...

Discussion

La recherche dans le domaine de la biologie de la reproduction, en particulier dans le domaine de la fertilité masculine et la spermatogenèse inévitablement s'appuie sur les organismes vivants. Afin d'examiner la fonction testiculaire, pas de système de culture cellulaire adéquate / in vitro a été mis en place capable de réfléchir tous les essentiels des changements morphologiques d'un spermatogonies diploïdes à un ^1,2 spermatozoïde haploïde maturité. Ainsi,...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Sigma	1-15 PK
Spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
Micropipette puller	Narishige	PC-10	vertical capillary puller
Microinjection capillaries	Clark	GC100-10	borosilicate standard wall
Micropipette beveler	Bachofer	Typ 462	rotating disk beveler
Electroporator	Nepagene	CUY 21EDIT	square wave electroporator
Tweezer electrodes	Nepagene	CUY 650P5	5 mm Ø disk electrodes
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000-C
Cold light source	Zeiss	KL 1500LCD
Microinjection pump	Eppendorf	Femtojet
Micromanipulator	homemade		XYZ cross table
Surgical instruments	FST		scissors, forceps, needle holder
Fine forceps	FST	Dumont #5, #7	efferent ducts preparation
Michel clip applying stapler	FST	Michel, 12029-12
Michel suture clips	FST	Michel, 12040-01	7.5 x 1.75 mm
Surgical suture	Catgut, Markneukirchen, Germany	Catgut 00
Syringe with 30 G needle	B. Braun	Omnican 40	to load micropipette and for anesthesia
Plasmid isolation kit	Promega	Cat. # A2495	plasmid Midiprep
Plasmid pEGFP-C1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + EGFP
Plasmid pDsRed2-N1	Clontech	Cat. #6084-1	CMV-promoter + DsRed2
Fast Green dye	Sigma	F7258-25G	for dilution in ddH2O
10% Ketamine	Serum Werk, Bernburg, Germany	Urotamin	mix in a rate 1:1 with xylazine
2% Xylazine	Serum Werk, Bernburg, Germany	Xylazin	mix in a rate 1:1 with ketamine
Sterilium	Bode Chemie	Sterillium	disinfection
Vet ointment	S&K Pharma, GmbH	Kerato Biciron 5%, Augensalbe	opthalmic ointment to prevent eye dryness
To-Pro-3 iodide	Invitrogen	T3605
10x PBS, pH 7.4
1.37 M NaCl	Carl Roth	3957.1
Ibuprofen, Dolormin	Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany	01094902	analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief
27 mM KCl	Carl Roth	6781.1
100 mM Na2HPO4·2H2O	Carl Roth	T106.2
18 mM KH2PO4	Carl Roth	3904.1