Usando tomografia Micro-computadas para a avaliação do desenvolvimento do tumor e Acompanhamento da resposta ao tratamento em um modelo do rato do cancro do pulmão

Resumo

We describe a method for the detection of tumor nodule development in the lungs of an adenocarcinoma mouse model using micro-computed tomography and its use for monitoring changes in nodule size over time and in response to treatment. The accuracy of the assessment was confirmed with end-point histological quantification.

Resumo

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse models of lung cancer are being used to study the mechanism of cancer development and to experiment with various therapeutic strategies. However, the absence of a real-time technique to identify the development of tumor nodules in mice lungs and to monitor the changes in their size in response to various experimental and therapeutic interventions hampers the ability to obtain an accurate description of the course of the disease and its timely response to treatments. In this study, a method using a micro-computed tomography (CT) scanner for the detection of the development of lung tumors in a mouse model of lung adenocarcinoma is described. Next, we show that monthly follow-up with micro-CT can identify dynamic changes in the lung tumor, such as the appearance of additional nodules, increase in the size of previously detected nodules, and decrease in the size or complete resolution of nodules in response to treatment. Finally, the accuracy of this real-time assessment method was confirmed with end-point histological quantification. This technique paves the way for planning and conducting more complex experiments on lung cancer animal models, and it enables us to better understand the mechanisms of carcinogenesis and the effects of different treatment modalities while saving time and resources.

Introdução

O cancro do pulmão é a principal causa de morte por câncer em todo o mundo ^1. A investigação sobre a prevenção, detecção precoce e tratamento do câncer de pulmão está em curso em muitos centros de pesquisa em todo o mundo ^2,3. Vários modelos animais para o cancro do pulmão têm sido desenvolvidos, e eles provaram ser úteis no estudo dos mecanismos da carcinogênese de pulmão e células de origem, para determinar a presença de células-tronco do câncer, e em examinar várias novas estratégias terapêuticas ^4. Modelos anteriores invocadas iniciação do tumor induzida por substância cancerígena em estirpes sensíveis de ratinhos ^5. O desenvolvimento de modelos transgénicos e knockout de rato em que o cancro do pulmão surge como uma consequência de lesões genéticas manipuladas especificamente melhorou substancialmente a capacidade de controlar a indução tumoral e imitam vários aspectos de cancro do pulmão humano ^4. No entanto, um desafio principal na utilização de modelos animais de cancro do pulmão é a ausência de um método em tempo real paraidentificar com precisão e controlar o aparecimento e desenvolvimento de tumores nos pulmões de ratinho e para documentar qualquer alteração posterior nos seus tamanhos, tais como o seu crescimento contínuo ou redução em resposta aos tratamentos. Isto forçou os pesquisadores a recorrer a várias tempo, esforço e técnicas que consomem recursos para identificar os tumores e avaliar os seus resultados experimentais. A presença de variação inerente inter-rato em resposta a indução do tumor requer o uso de um grande número de animais em cada grupo experimental para reduzir a variabilidade de dados. A incapacidade de avaliar o crescimento do tumor ou resposta ao tratamento em tempo real tem forçado os pesquisadores a eutanásia cegamente ratos em vários pontos de tempo em protocolos experimentais prolongados para garantir que eles vão recolher os dados corretos, resultando no desperdício de recursos a partir das amostras coletadas em pontos de tempo que são demasiado cedo ou demasiado tarde.

No presente estudo, um método para explorar um pequeno animal micro-cA tomografia omputed (micro-CT) scanner para detectar e acompanhamento tumores de pulmão em camundongos vivos é introduzido. Nós usamos nossa recentemente descrita SFTPC-rtTA e Tre-FGF9-ires-eGFP double-transgênica (DT) ratos que desenvolvem rapidamente adenocarcinoma pulmonar após a indução com doxiciclina ^6,7. O uso de micro-CT nos permite (entre outras coisas) excluem ratinhos com anormalidades pulmonares aberrantes antes da indução, confirmar o desenvolvimento de nódulos tumorais no pulmão após a indução, e observar as alterações em nódulos de tumor em resposta a tratamentos experimentais. ponto final a eutanásia dos ratos e avaliação histológica confirmou a precisão da avaliação em tempo real realizado com micro-CT. Nós acreditamos que esta técnica irá pavimentar o caminho para a realização de experiências mais bem planejadas utilizando modelos animais de câncer de pulmão, poupando recursos valiosos, encurtando o tempo de observação e aumentando a precisão e compreensão dos resultados.

Protocolo

Experiências com animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal da Universidade de Keio.

Nota: Neste estudo, foram utilizados os ratos Tre-FGF9-ires-eGFP DT em que o adenocarcinoma do pulmão desenvolve-se rapidamente após a indução, alimentando ração contendo doxiciclina ^6,7 SFTPC-rtTA e. No entanto, todos os procedimentos de avaliação pode ser aplicada a outros modelos de ratinho do cancro do pulmão.

1. Experiência Outline:

1. Identificar o estado dos pulmões na linha de base:
   1. Antes da indução do tumor, quando os ratos DT são 8 - 12 semanas de idade, realizar o primeiro exame micro-CT (ver secções 2 e 3 abaixo). Isto serve como a verificação da linha de base do pulmão, confirma a ausência de nódulos desenvolvidos espontaneamente provocados por um transgene gotejante, e documentar a ausência de qualquer patologia pulmonar existente antes da indução de tumores.
2. Iniciar a indução de tumor:
   1. Alternar os ratos DT de ch regularesomo Chow doxiciclina para induzir o factor de crescimento de fibroblastos (FGF) 9 expressão nas células alveolares e para iniciar o desenvolvimento do tumor. Dê comida de doxiciclina (200 ppm) ad libitum.
3. Confirmar o desenvolvimento de nódulos de tumor nos pulmões do rato:
   1. Executar uma varredura micro-CT para identificar o desenvolvimento de nódulos tumorais em comparação com o exame de pré-indução.
4. Avaliar a resposta ao tratamento:
   1. Para testar a capacidade do micro-CT para detectar mudanças na nódulos tumorais em resposta ao tratamento, administrar o inibidor da FGF Receptor (FGFR) AZD4547, em seguida, executar scans adicionais micro-CT após 5 e 10 semanas.
5. Avaliação ponto final:
   1. Eutanásia todos os ratos de controle e tratamento e tecidos de processo para avaliação histológica (ver secção 6 abaixo).

2. Ratos preparando para Micro-CT Aquisição de Imagem:

1. Ligue o scanner micro-CT e computador.
2. ClicK no software chamado "R_m CT2", depois clique em "aquecer".
3. Remova a cama amostra sobre a qual o mouse será colocado da câmara de micro-CT. Enrole a cama com filme plástico.
4. Defina a caixa de indução da anestesia, adicionando isoflurano para o vaporizador de anestesia até o nível marcado. Definir a taxa de fluxo de isoflurano a 3 L / min.
5. Abra o tanque de oxigênio para iniciar o fluxo de oxigênio na caixa de indução e definir a taxa de fluxo de 1 L / min.
6. Posicione o mouse na caixa de indução da anestesia e confirmar que ele está profundamente anestesiados pela ausência de movimento espontâneo e em resposta a uma pitada de pele (uma pitada suave de uma pequena dobra de pele, que não causa danos nos tecidos ou fim da pele).
7. Aplicar um lubrificante ocular para prevenir o ressecamento da córnea durante a anestesia.
8. Abra a câmara de micro-CT e coloque o mouse com o lado dorsal em cima da cama amostra. Mantenha a cabeça do rato e puxar o corpo para baixo a partir dos membros inferiores em order para alongar e endireitar o corpo simetricamente.
9. Desligue o fluxo de anestesia para a caixa de indução e ligá-lo para o tubo que liga à câmara de micro-CT.
10. Coloque o tubo de anestesia no nariz do rato para administrar anestesia contínua.
11. A fim de corrigir o mouse na posição; embrulhar o mouse ea cama amostra com filme plástico.
    Nota: É fundamental para manter o rato sob anestesia profunda e envolveu até a cama de amostras, porque qualquer movimento ligeiro ou torção de seu corpo durante a varredura irá resultar em imagens nebulosas e dificuldade de interpretação.
12. Feche a câmara de micro-CT.
13. Ajustar o sistema de micro-CT a 90 kV e 160 mA e o tempo de verificação para 4,5 min. Defina o intervalo para 24 × 19 mm e o tamanho voxel a 50 × 50 × 50 mm. Use o modo síncrono para batimentos cardíacos.
14. Criar uma nova pasta no "banco de dados", a fim de salvar novas imagens na pasta.
15. Inicie a digitalização.
16. Após a conclusão da verificação, mova o mouse em uma gaiola vazia e observá-lo até que ele recupere a consciência. Não colocá-lo com outros ratos até que ele se recuperou totalmente dos efeitos da anestesia.

3. Pré-indução Micro-CT visualização e análise de imagens:

1. Para visualizar as imagens micro-CT, baixar o software ImageJ gratuitamente do seguinte site: http://imagej.nih.gov/ij/ . Nota: Cada arquivo de dados de micro-CT é uma pilha de aproximadamente 500 TIF Files (.tif). Outro software de visualização de imagem também pode ser usado.
2. Abra as seriais micro-CT arquivos de imagem e percorrer todas as imagens de cada rato a partir do pescoço até o abdômen, ou vice-versa.
3. Usando varreduras de ratinhos de tipo selvagem sem tratamento prévio, identificar a densidade de diferentes zonas e estruturas anatómicas normais no peito com base no conhecimento da anatomia do rato (ver Figura 1A).
   1. Mantenha o cursor com orato do computador e vá para cima, a partir de vísceras abdominais esbranquiçados e diafragma, através do peito e até o pescoço.
   2. Identificar os ósseas marcos gaiola peito (esterno na frente, vértebras nas costas e costelas nas laterais).
   3. Identificar o coração na parte da frente do peito e os grandes vasos sanguíneos perto do coração e no mediastino.
   4. Observe o lúmen traquéia (como um pequeno círculo escuro ao nível do pescoço e parte superior do tórax), que bifurca para a direita e brônquios principais esquerdo, em seguida, continuar a sucursal em brônquios cada vez menores. Note-se que cada um brônquio está intimamente associada com dois ou três vasos sanguíneos (Figura 1A).
4. Começar a examinar os exames de ratos DT induzida por un e identificar a presença de quaisquer anormalidades.
   1. Excluir ratos com sombras anormais pré-indução de pulmão (por exemplo, nódulos, bolhas de enfisema, etc.) de quaisquer outras experiências. (Figura 1C-E, G, H ).

Indução 4. Tumor:

1. Para induzir o desenvolvimento de tumores em camundongos experimental que mostrou scans pulmão normal, mude sua alimentação a partir de ração normal para ração contendo doxiciclina (200 ppm).

5. exames de acompanhamento:

1. Após 10 semanas, realizar um segundo exame micro-CT de todos os ratos para confirmar o desenvolvimento de nódulos de tumor nos pulmões (ver Figura 2).
2. Dividir os ratos em dois grupos. Administrar o AZD4547 FGFR bloqueador (125 ug / kg / dia por meio de um tubo gástrico durante 6 dias / semana durante 10 semanas) a um grupo de placebo e um com o outro grupo de controle para mais de 10 semanas.
3. Acompanhar as mudanças nas sombras nodulares através da realização de uma terceira varredura 4 - 5 semanas mais tarde.
4. No final de 10 semanas de tratamento, realizar uma quarta varredura.
5. Eutanásia todos os ratinhos com inalação de _CO2 ou com injecção intraperitoneal de 0,1 mg / 200 ul de pentobarbital.
6. Paraidentificar as mudanças dinâmicas nos nódulos tumorais após a indução e na resposta ao tratamento, identificar posições semelhantes dentro das imagens de digitalização em série do mesmo mouse em dois ou mais diferentes pontos de tempo, em seguida, verificar se há o aparecimento / desaparecimento de quaisquer sombras anormais (Figura 3 ).
7. Para facilitar a identificação do mesmo plano, no mesmo rato em diferentes pontos de tempo, tentar associar o plano de interesse com as estruturas anatómicas marco dentro do peito do rato.
   1. Use pontos de referência, tais como a traqueia, sua bifurcação, o direito e os brônquios principais esquerdo, aorta, diafragma e grandes vasos sanguíneos.
      Nota: ossos da caixa, incluindo as vértebras torácicas, costelas e esterno são menos úteis como marcos de posicionamento por causa de inclinações menores comuns no alinhamento do corpo do mouse sobre a cama da amostra, o que aumenta a possibilidade de má interpretação da posição de digitalização. Da mesma forma, o número de série imagem dentro do ficheiro de digitalização é confiável para identifying na mesma posição ao longo do tempo devido à mudança do comprimento do corpo do rato a partir de um ponto de tempo para outro. A falha ou imprecisão na identificação do mesmo plano, em diferentes pontos no tempo podem resultar na interpretação falsa positiva / negativa dos resultados.

6. Rato Eutanásia e coleta de pulmão:

1. Eutanásia ratos com inalação de _CO2 ou com injecção intraperitoneal de 0,1 mg / 200 ul de pentobarbital.
2. Expor as vísceras abdominais por corte longitudinal através da parede abdominal. Purgar o rato para reduzir o volume de sangue nos pulmões por dissecação da aorta abdominal.
3. Cortar o diafragma com uma tesoura fina; isto irá resultar na perda da pressão negativa da cavidade torácica, assim colapso dos pulmões. Expor os pulmões e coração por corte e remoção de partes dos reforços da parede torácica anterior. Limpe a parte frontal do pescoço, cortando a pele e tecidos moles para expor o Tracheuma.
4. Cortar o coração e glândula timo. Inserir uma pinça por trás da traquéia para separá-lo do esôfago.
5. Canular a traqueia com uma cânula G24, em seguida, fixá-lo no lugar apertando um fio ao redor da parte inserida.
6. Inflar e fixar o pulmão utilizando gelada 4% de paraformaldeído (PFA) através da cânula traqueal, utilizando uma coluna de 25 cm. Retire a cânula e aperte o fio para evitar vazamento PFA, em seguida, cortou a traqueia superior fora o seu apego à laringe.
7. Puxe a traqueia do fio de sutura e dissecá-lo a partir de sua fixação, e continuar para baixo para removê-lo com o pulmão en -bloco. Inseri-lo em um tubo de 15 ml contendo 5 ml de 4% PFA. Deixar os pulmões em PFA O / N para assegurar a penetração no tecido completo e fixação, em seguida, processar o tecido em um bloco de parafina padrão ^8.
8. Cortar blocos de parafina em 6 fatias um-grossas em um micrótomo e mancha com hematoxilina e eosina, utilizando técnicas convencionais.

7. Avaliação Histológica:

Nota: Embora a utilização de um "scanner de slides" para avaliação histológica digital é descrito aqui, a utilização de microscópios regulares e avaliação histológica visual para avaliação também é possível.

1. Ligue o instrumento scanner de slides e computador.
2. Clique no software "varredura NDP".
3. Selecione o modo de digitalização "Lote de diapositivos" e "Semi-Auto Mode" para a digitalização de uma série de slides.
   Nota: O braço robótico que apanha as lâminas durante o varrimento sequencial é muito sensível a quaisquer irregularidades nas bordas das lâminas de vidro.
4. Apalpar as bordas de todas as lâminas de vidro antes de carregá-las na máquina. Se houver alguma saliência da tampa de vidro ou meio de montagem seca, limpe-a com um cortador ou um bisturi.
5. Coloque os slides em uma gaveta deslizante. Abra a escotilha amostra e deslizar a cassete para a posição "um";. Feche a porta.
6. No software de computador, dar nomes descritivos curtos para todos os slides em sua posição correspondente na gaveta, em seguida, clique no botão "OK".
7. Selecione o modo de perfil: "Brightfield".
8. Clique em "Iniciar Batch" para iniciar a digitalização provisória.
   Nota: Quando a máquina terminar a digitalização de todos os slides, o software irá automaticamente detectar áreas com tecidos em todos os slides e sugerir-lo como uma região de interesse.
9. Se necessário, redefinir a região de interesse, mantendo pressionado o botão esquerdo do mouse e puxando a fronteira região.
   Nota: A definição excessivamente grandes áreas dos slides como as regiões de interesse irá resultar em um tempo muito maior de digitalização.
10. Uma vez satisfeito com as regiões de interesse em todos os slides, clique em "Scan" para iniciar a digitalização de todos os slides.
    Nota: Os arquivos digitalizados podem ser observadas digitalmente em baixa e alta resolução, e as imagens podem ser exportadas como JPEGarquivos.

Resultados

Identificação de camundongos com anormalidades pulmonares foi realizada no início do estudo. Antes da indução do tumor, quando os ratinhos foram DT 8 - 12 semanas de idade, os pulmões de todos os ratos foram verificados com micro-CT. Surpreendentemente, aproximadamente 50% dos camundongos mostraram anormalidades que obrigou-nos a considerá-los inadequados para inclusão no estudo subsequente. Estas anormalidades eram sombras nódulo-like, grande pequeno bolhas de enfisema simples ...

Discussão

O método baseado em micro-CT descrito aqui para a identificação em tempo real de anormalidades pulmonares e acompanhamento do desenvolvimento de nódulos tumorais e a resposta ao tratamento em modelos animais de cancro do pulmão vai permitir aos cientistas que estão conduzindo experiências relacionadas ao câncer de pulmão planejar mais experimentos precisos e eficientes, poupando tempo e recursos. Nós já usou ressonância magnética para o mesmo efeito ^6. A clareza da digitalização e do limiar par...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
micro-X-ray–computed tomography	Rigaku	R_mCT2
NanoZoomer RS Digital Pathology System	Hamamatsu	RS C10730
NDP.view2 Viewing software	Hamamatsu	U12388-01	http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html
Isoflurane Vaporizer - Funnel-Fill	VETEQUIP	911103
Induction chamber, 2 Liter  W9.5×D23×H9.5	VETEQUIP	941444
Isoflurane	Mylan	ES2303-01
AZD 4547	LC Labratories	A-1088
Pentobarbital	Kyoritsu	SOM02-YA1312
G24 cannula	Terumo	SP-FS2419
Paraformaldehyde	Wako	163-20145
Microtome	Leica	RM2265
Doxycycline	SLC Japan/PMI Nutrition International	5TP7
ImageJ software	National Institute of health		http://imagej.nih.gov/ij/
Puralube vet ointment (Occular lubricant)	Dechra	NDC 17033-211-38