Flujo de trabajo completo para el análisis de las histonas modificaciones post-traduccionales El uso de espectrometría de masas de abajo hacia arriba: A partir de la histona Extracción de Análisis de Datos

Nucleosomas son la unidad estructural más pequeña de la cromatina, compuesta de 147 pares de bases de ADN envueltos alrededor de un octámero de proteínas histonas. la función de la histona está mediada por una amplia modificación posterior a la traducción por una miríada de proteínas nucleares. Estas modificaciones son críticas para la integridad nuclear ya que regulan la estructura de la cromatina y reclutar enzimas implicadas en la regulación génica, la reparación del ADN y la condensación de los cromosomas. A pesar de que una gran parte de la comunidad científica adopta técnicas basadas en anticuerpos para caracterizar la histona abundancia PTM, estos enfoques son el bajo rendimiento y sesgada contra proteínas hypermodified, ya que el epítopo puede ser obstruida por modificaciones cercanas. Este protocolo describe el uso de cromatografía líquida de nano (NLC) y espectrometría de masas (MS) para la cuantificación precisa de modificaciones de las histonas. Este método está diseñado para caracterizar una gran variedad de PTM histonas y la abundancia relativa de varios de histonas variantes dentro de sanaliza la ingle. En este protocolo, las histonas se derivatizan con anhídrido propiónico seguido por la digestión con tripsina para generar péptidos de 5-20 aa de longitud. Después de la digestión, la recién expuesta N-terminales de los péptidos de histonas se derivatizan para mejorar la retención cromatográfica durante nLC-MS. Este método permite la cuantificación relativa de PTM histonas que abarcan cuatro órdenes de magnitud.