Histon Ekstraksiyon Gönderen Data Analizi: Aşağıdan yukarıya Kütle Spektrometre kullanarak histon post-translasyonel modifikasyonlar Analizi için komple iş akışı

Özet

Bu protokol, kütle spektrometrisi (MS) ile histon post-translasyonel modifikasyonları karakterize etmek için tamamen entegre bir iş akışı özetlenmektedir. iş akışı nano-akış sıvı kromatografi ve veri analizi için talimatları kullanarak hücre kültürlerinde veya dokular, histon türetilmesi ve sindirim, MS analizi gelen histon arınma içerir. 3 gün - protokol 2 içinde tamamlanması için tasarlanmıştır.

Özet

Nükleozom histon proteinleri bir oktamer sarılı DNA 147 baz çifti oluşan kromatin küçük yapısal birimi vardır. Histon fonksiyonu, nükleer proteinlerin sayısız tarafından kapsamlı post-translasyonel modifikasyon aracılık eder. Onlar gen regülasyonu, DNA tamiri ve kromozom yoğunlaşma katılan kromatin yapısı ve işe enzimleri düzenleyen olarak bu değişiklikler, nükleer bütünlüğü için kritik öneme sahiptir. bilimsel topluluğun büyük bir kısmı histon PTM bolluk karakterize etmek antikor bazlı teknikleri benimser olsa epitop yakın değişikliklerle engel olabileceği gibi, bu yaklaşımlar, düşük verimlilik ve hypermodified proteinlere karşı önyargılı. Bu protokol, histon modifikasyonlarının tayini için daha kesin nano sıvı kromatografisi (nlC) ve kütle spektrometrisi (MS) kullanımını tarif etmektedir. Bu yöntem, histon PTMS çok çeşitli ve çok sayıda histonun göreceli olarak karakterize etmek için tasarlanmıştır s içinde varyantlarıingle analiz eder. uzunluğu 20 AA - Bu protokol, histonlar 5 peptidleri üretmek üzere tripsin ile sindirme ile ve ardından propiyonik anhidrid ile türetilir. Sindirimden sonra, histon peptitlerin yeni maruz kalan N-termini nlC-MS sırasında kromatografık tutma özelliğinin geliştirilmesi için türetilir. Bu yöntem, dört büyüklük düzeyinde kapsayan, histon PTMS rölatif ölçümü sağlar.

Giriş

Epigenetik altta yatan DNA dizisi ^1. değiştirerek dışındaki mekanizmalar ile ortaya çıkan, gen ekspresyonunda kalıtımsal değişikliklerin çalışma olarak tanımlanır. Organizma dramatik fenotipik kendi DNA içeriği değişmez olsa bile değiştirir uğrar gibi epigenetik düzenleme gelişimi sırasında kritik önem taşımaktadır. Farklı mekanizmalar ² vasıtasıyla gen ekspresyonunu etkileyen her biri histon post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS), histon varyantları, kodlayıcı olmayan RNA'lar, DNA metilasyonu ve DNA bağlama faktörler de dahil olmak üzere uygun bir epigenetik bakımı için gerekli kritik bileşenleri vardır. Örneğin, ise DNA metilasyonu geni çeviri ^3, histon varyantları ve histon PTMS daha dinamik ve şekillerde ⁴ çeşitli kromatin etkileyebilir bastıran oldukça dengeli bir modifikasyonudur.

en çok maruz kalan ve esnek bölgesi olarak Histon PTMS çok N-terminal kuyrukları lokalizeprotein. Ancak, nucleosome çekirdek de ağır ortalama proteinler ⁵ ile karşılaştırıldığında modifiye edilir. histon işaretleri yaygın son on yılda karakterize edilmiştir olsa da, bilinen histon işaretleri ve bunların fonksiyonu arasındaki birçok bağlantılar hala belirsiz. Bu en histon PTMS transkripsiyon ^6,7 gibi belirli bir süreç değiştirmek için diğer PTMS ( "cross-talk") ile tandem oldukça işlevi yalnız çalışmak değil, gerçeği büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Örneğin, gen p21 ile kombinasyon işareti H3S10K14ac iki PTMS ⁸ yalnızca birinde ortaya değil, transkripsiyonu aktive eder. Protein HP1 sıkıştırır H3K9me2 / Me3'ten seçilen tanıma ve yakındaki nükleozom için değişiklik yayarak kromatin. Bitişik S10 ⁹ fosforile olduğunda ancak, HP1 H3K9me2 / 3 bağlamak mümkün değil. H3K4 asetilasyonu Schizosaccharomyces pombe ¹⁰ H3K9me2 / Me3 protein spChp1 bağlanmasını engeller. Ayrıca, histon lizin Demethylase PHF8 üç PTMS H3K4me3, K9ac ve K14ac ^11, bu en yüksek nükleozom bağlayıcı etkinliğe sahiptir. Bu örnekler histon PTM değişikliklerin küresel bir bakış elde ziyade tek değişiklikler odaklanarak önemini vurgulamaktadır.

dizinin varlığı da varyantları histon izotipleri genellikle oldukça benzer dizilere sahip olarak, histon analiz karmaşıklığını artırır, ancak genellikle kromatin farklı rollere sahiptir. Örneğin, H2A.x daha kolay kanonik H2A ¹² göre DNA hasarı üzerine fosforilatlanır bir C-terminal dizisine sahiptir, ve erkek farenin mayoz ¹³ cinsiyet kromozom inaktivasyonu için gereklidir; Benzer şekilde, CENP-A sentromer ¹⁴ kanonik histon H3 yerini alır. Farklı fonksiyonların rağmen, bu varyant belirlemek ve bunları ayrı ayrı ölçmek güçleştirir ilgili standart histon ile amino asidi dizisinin büyük bir bölümünü paylaşmaktadır.

Böyle batı blot olarak antikor bazlı teknikler yoğun histon karakterize etmek kabul edilmiştir. Bununla birlikte, antikor bazlı yaklaşımlar, aşağıdaki nedenlerden dolayı sınırlıdır: (i) sadece modifikasyon varlığını teyit edebilir ve bilinmeyen PTMS belirleyemez; (Ii) bağlı bir bağlanma afinitesine etkileyebilir birlikte mevcut olan bakışı varlığında şekilde bastırılmaktadır; (iii) sadece çok az sayıda antikorlar, amacı ve (iv) çok benzer histon varyantları ya da benzeri PTMS (örneğin, di- ve lizin kalıntılarının trimethylation) arasındaki çapraz reaksiyona için uygun olarak, kombinasyon işaretleri tespit edilemez. Egelhofer ve ark. Ticari antikorların% 25'ten fazla nokta leke veya Western blot ile özgüllük testleri başarısız ve spesifik antikorlar arasında% 20'den fazla kromatin immüno deneyler ¹⁵ başarısız tanımlanmıştır. Kütle spektrometrisi (MS) şu anda, yeni ve / veya kombinasyon PTMS çalışma için en uygun bir analitik araç olduğunuve yaygın ⁽¹⁶ gözden) histon proteinler için uygulamaya konmuştur. Bu, yüksek hassasiyet ve MS kütle hassasiyeti, ve büyük ölçekli analiz gerçekleştirmek için olasılığı çok bağlıdır.

(- 20 aa 5) aşağıdan yukarı bir strateji Sağlam protein enzimatik kısa peptitler sindirilmiş burada histon karakterizasyonu ve PTMS için en yaygın olarak kullanılan MS tabanlı proteomik stratejidir. Bu sindirim LC ayrılması ve MS algılama hem de kolaylaştırır. 600 aralığında Kitleler - 2000 Da yaygın daha kolay iyonize ve daha geniş kitlelere daha yüksek kitle doğruluk ve çözünürlük ile tanımlanır. MS / MS parçalanması da kısa peptidler genellikle Çarpışmanın neden olduğu ayırma (CID) için çok uygundur, artırıldı. Bunlar son derece bazik amino asit kalıntısı, yani lisin ve arginin açısından zengin olan Ancak, histonlar aşağıdan yukarı MS için sorunlara neden olabilmektedir. Bu nedenle, bir şekilde tripsin emdirme çok sm olan peptidlerin oluşumuna yol açantüm LC tutma ve PTMS kesin lokalizasyonu için. Bu sorunu aşmak için, bizim protokol lizin ve peptit N-terminal kimyasal türetme ¹⁷ içermektedir. Propiyonik anhidrid kullanılması diğer reaktifler ¹⁸ ile karşılaştırıldığında etkili kimyasal türetme için tavsiye edilir. Tripsin, sadece arginin kalıntılarının, C-terminalindeki proteolizini gerçekleştirmek için izin Bu türetme blok edilmemiş ve monometil lizin kalıntılarının ɛ-amino grupları. Türetilmiş aminler çözümü ile protonları alışverişi olamaz ve bu nedenle peptitler genellikle sadece çift veya triply MS ve MS / MS algılama kolaylaştırmak, tahsil edilir. Ayrıca, N-terminal türetme peptit hidrofobiklik ve böylece ters faz kromatografik arttırır. Burada, histon arındırmak ve aşağıdan yukarıya proteomik (Şekil 1) üzerinden PTM analiz için onları hazırlamak için iş akışını açıklar. Bu strateji, tek histon işaretleri ve kombinasyon işaretleri f miktarının eldeamino asit dizisinde nispeten yakın olan ya da histon PTMS.

Protokol

Kültür hücreleri 1. Koleksiyonu

1. Hücreler süspansiyon içinde büyütülmüştür için, 5 dakika boyunca 300 rcf de santrifüj ile hücreler toplanır. yapışık, aspirat ve atın hücre orta edin. Ca ^{+ 2} ve Mg ^{+ 2} olmaksızın PBS ile bağlanmış hücrelerin yıkayın (PBS ileriye olarak da adlandırılır). Hücreler (zaman farklı hücre hatları için değişir) ayrılana kadar 37 ° C'de plakalar yüzeyini kapsayacak şekilde yeterli hacimde - (% 0.5 hücre hattına bağlı olarak% 0.025) tripsin ya tripsin-EDTA ya hücreleri inkübe edin.
2. 5 dakika boyunca 300 rcf de santrifüj ile hücreler toplanır. PBS hücrelerin iki kez daha yıkanır ve santrifüj ile toplanır.
3. 1.8 ml tüpler veya 15 ml konik tüpler üzerinde işaretlenmiş mezuniyet yaklaşık paketlenmiş hücre hacmi tahmin edin.
   Not: kültür içindeki hücreler, sıvı azot içinde hızlı bir şekilde dondurulup bu aşamada -80 ° C süresiz olarak saklanabilir.

Bozulmamış hücrelerinden Çekirdeklerin 2. izolasyonu

1. Buz üzerinde Çözülme hücreleri.
2. Çözülme nükleer izolasyon tamponu (NIB, Tablo 1).
3. Her 100 ul paketlenmiş hücre hacmi yaklaşık 5 mi NIB tamponu (Tablo 1) hazırlayın. 1 M DTT 1 ul, 200 mM AEBSF'in 2.5 ul, 2.5 uM Microcystinin, 5 M sodyum bütirat 2 ul 2 ul aşağıdaki gibi her 1 mi NIB tamponu, proteaz inhibitörleri ve stabilize edici maddeleri ekleyin. inhibitörlerle NIB bu noktadan sonra NIB şu şekilde de ifade edilecektir.
   Not: histon fosforilasyonu okudu ise, EDTA içermeyen proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyl içerir.
4. NIB tamponu beşinci hacmi Bu şekilde hazırlanan çıkarın ve% 0.2 bir son konsantrasyona NP-40 Alternatif (Tablo 1) ekleyin. Geri kalan dört beşinci cilt yıkama için kullanılır.
5. NP-40 Alternatif oranı olmayan NIB 1:10 hücre peleti içerisindeki bir yıkama, hücre peleti (hac / hac). 5 dakika boyunca 700 rcf de santrifüj ile süpernatantı.
6. lyse celbuz üzerine yerleştirerek ve% 0.2 NP-40 alternatif NIB 1:10 hücre tanesinin eklenmesi ile l pelet (hac / hac).
7. doku örneklerinden ayıklanması ise, havan ve dibek veya Dounce homojenizatörlerinin kullanarak homojenize. Kültürlenmiş hücreler yavaşça pipetleme homojenize edilebilir.
8. 10 dakika - 5 buz üzerinde homojenize hücreleri inkübe edin. Hücreler parçalanması ve çekirdekleri yayınlayacak.
9. 10 dakika 4 ° C'de 5 - 1,000 rcf de santrifüj. süpernatant çoğunlukla sitoplazmik bileşenleri içerir ise pelet çoğunlukla çekirdekleri hücre içerir. İstenirse sitoplazmik bölümünü kaydedin.
10. yavaşça NP-40 alternatifi olmayan 1:10 oranında (v / v) NIB içinde yeniden süspanse çekirdeklerin pelet yıkayın.
    Not: Bu yıkama adımı önceki çekirdeklerin gelen histon ayıklanması için deterjan izlerini silmek için sadece olduğunu.
11. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1,000 rcf de santrifüj ve supernatant çıkarın.
12. Tekrarlayın Adım 2,10-2,11 en az iki kez tamamen NP-40 Alternatif kaldırmak için. NP-40 Alternatif çıkarılması belirgin bir olduğunuyıkama aşaması artık kabarcıkları oluşturur sırasında hafif bir pipetleme s.
13. dokulardan histon çıkarımı için:
    1. buz ELVES taze veya çözülmüş dondurulmuş doku durulayın.
    2. ıslak doku tutmak için yeterli, ucu da buz üzerine yerleştirilen bir petri doku aktarın.
    3. jilet ile küçük parçalara (<1 mm) içine Zar çekirdek izolasyonu için yüzey temasını arttırmak için.
    4. önceden soğutulmuş homojenizatör kıyılmış doku transferi ve yukarı ve aşağı pipetleme ELVES yıkayın.
    5. 5 dakika boyunca 300 RCF santrifüjle tamponu çıkarın.
    6. Bir hücre hücrelere NIB ihtiva eden NP-40 Alternatif ekleyin: 1:10 oranında tampon (h / h) ve 5 ile homojenize - 10 vuruş.
    7. hücre erimesi için kontrol edin ve gerekirse homojenizasyon tekrarlayın. hücrelerinin parçalanmış edildiğini iyi bir gösterge pelet hacminin azalması. pelet sadece çekirdekleri içermelidir.
    8. 5 dakika boyunca 700 RCF Santrifüj ve pelet kaydedin. 2 kez daha - Bu pelet 1 elde edilebilir1:10 S (v / v) NIB NP-40 Alternatif içeren; Bu aşamada, histonlar kromatin üzerinden ekstre edilir ve topak ölçüde çekmiş sahiptir.
    9. deterjan kalıntılarını çıkarmak için NP40 alternatifi olmayan NIB 3 ml - 2 ile iki kez yıkanır.
       Not: Ara durma noktası: Örnek NIB +% 5 gliserol, minimum hacimde yeniden süspansiyon haline getirildi ve -80 ° C'de muhafaza edilebilir.

Çekirdeklerin gelen histon 3. Emme ve Arıtma

Not: Histonlar sıkı DNA fosforik asit omurgasına etkileşim izin vermeden, bazik amino asit kalıntısı çok zengindir. Histonlar, çekirdekte, en temel proteinler arasında bu şekilde onları güçlü asit çökeltilmesi histon olmayan proteinleri, en az kirlenme ile buz soğukluğunda sülfürik asit (0.2 MH _{2SO 4)} 'de elde edilebilir izin verir. (% 33 bir son konsantrasyona kadar) yüksek konsantre TCA sülfürik gelen histonları çökeltmek için kullanılabilirasit. TCA 4 ° C'de kahverengi bir şişede,% 100 olarak saklanır.

1. Tekrar süspansiyon hücre çekirdekleri, 1: 5 (v / v) hafif bir pipetleme 0,2 MH ₂ SO ₄ (Tablo 1) soğutulmuş.
2. 4 ° C'de 4 saat - sabit dönme ya da hafif 2 çalkalanarak örnek inkübe edin. Tipik haliyle, 500'den ul hücre peleti numuneler için 2 saat ekstraksiyon histonları çıkarmak için yeterlidir; daha uzun kuluçka diğer temel protein ekstre neden olabilir. Daha küçük nükleer pelet (<200 ul), 4 saat ekstraksiyon daha iyi bir verim sağlar.
3. 5 dakika boyunca 4 ° C'de 3,400 rcf de santrifüj.
4. Yeni bir tüp süpernatant aktarın.
5. herhangi bir çözünmeyen malzemenin ayrılması için 3.4 - Tekrar 3.3 adımları tekrarlayın.
6. Histon çökeltilmesi için, 1 oranında toplanan süpernatant (şimdi içeren histonlar) soğutulmuş% 100 TCA (Tablo 1) ekleyin: 3 (v / v),% 33 bir son TCA konsantrasyonu elde etmek amacıyla. tüpü birkaç t ters çevirerek karıştırınimes.
   Not: Numune histon varlığını gösteren, TCA ilavesiyle parçalı döner.
7. en az 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe karışımı. Daha küçük bir başlangıç ​​pelet boyutları için, bir gecede yağış tavsiye edilir.
8. 5 dakika boyunca 3.400 RCF santrifüj. histon ceket tüpleri yanları ve aynı zamanda alt mevduat. Beyaz çözünmez pelet da çoğunlukla sigara histon proteinler ve diğer biyomoleküllerin içeren tüp, çok alt kısmında oluşturur. dikkatle yanlarını veya pelet kazıma olmadan, aspirasyon ile süpernatantı.
9. Taraf ve alt kaplama çökelmiş proteinleri kapsayacak şekilde, bir cam Pasteur pipet kullanılarak, buzla soğutulmuş aseton +% 0.1 HCI (Tablo 1) ile tüp yıkayın.
10. dikkatle yanlarını veya pelet kazıma olmadan 2 dakika ve aspirat süpernatant için 3400 RCF santrifüj.
11. 100% buz gibi soğuk aseton kullanılarak 3.10 - Tekrar 3.9 adımları tekrarlayın.
12. hava akımı ile ya da bir vacu ile kuru peletum, ya da sadece açık tüp bırakarak santrifüj. Aseton çabuk buharlaşır.
13. Tamamen beyaz tabakayı eritmek için mümkün olan en az hacimde GKD ₂ O (çift distile su) ile histon eritin. Histonlar suda kolaylıkla çözünebilir. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde peletler, 100 ul GKD ₂ O genellikle yeterli histonları toplamaktır.
14. 2 dakika boyunca 3.400 RCF santrifüj ve yeni bir tüpe süpernatantı aktarın.

Protein Konsantrasyonu ve Saflık 4. Tahmini

1. Protein konsantrasyonunun ölçülmesi için, BCA, Bradford protein deneyi ya da amino asit analizi (AAA) kullanın. histonlar aromatik amino asit kalıntısı zayıf olarak, 280 nm'deki absorbans kabul teknikleri kullanmayın.
2. % 15 akrilamid jeli ve Coomassie boyama (isteğe bağlı), SDS-PAGE analizi ile ekstre histon saflığını teyit.
3. Yüksek saflıkta bir histon varyantları istenirse, HPLC-UV fraksiyonasyon devamhiston varyantları (Bölüm 5). Değilse, aşağıdan yukarıya histon PTM analizi (bölüm 6) için hazırlık örnek doğrudan atlamak.

Ters-faz HPLC ile histon Variantların 5. Ayırma (İsteğe bağlı)

Not: Yüksek saflıkta histon varyantları, bir UV detektörü ile bağlanmış ters fazlı HPLC kullanılarak, ham histon karışımı kısımlara ayrılmasıyla elde edilebilir. Bu saflaştırılmış histon yüksek hassasiyet ve saflık gerektiren çalışmalar için yararlıdır. analizi yeterince hassas ve ayrıntılı çünkü Ancak, standart histon PTM karakterizasyonu için, bu adım atlanabilir. bozulmamış histon Fraksiyonu ideal varyantları en az 100 gerektirir - başlangıç ​​malzemesinin 300 mikrogram.

1. Yaklaşık 100 ug histonların 0.2 ml / dakika bir akış hızı ile 2.1 mm x 250 mm kolonu kullanmak;: Başlangıç ​​histon konsantrasyonuna bağlı olarak, bir HPLC'ye uygun bir _C18 5 um sütunu iletişime yaklaşık 300 ug histonlarla, 4.6 x 250 mm kolonu kullanmak/ Dakika, 0.8 ml bir akış hızı. aşağıdaki gibi Tampon A ve B özel cam kullanarak hazırlayın:
   1. Tampon A Hazırlama:% 5 HPLC dereceli asetonitril,% 0.1 TFA HPLC dereceli su içinde.
   2. HPLC dereceli su içinde% 95 HPLC sınıfı asetonitril,% 0.1 TFA: Tampon B hazırlanması.
2. UV dedektörü sütun bağlayın ve 210 absorbans ayarlamak - 220 nm.
3. % 0.1-1 bir TFA nihai konsantrasyona ulaşmak için% 100 TFA ile su içinde çözülmüş histon numunesi asitler.
4. Yaklaşık üç kolon hacmi gelen önerilen akış oranı, en az 15 dakika boyunca% 100 tampon A ile bir sütun dengelenmesi. UV dedektörü sıfır absorbans seviyesini ayarlamak için bu sinyali kullanın.
5. elle veya otomatik numune kollektör kesirler toplamak için uygun boyutta tüpleri hazırlayın.
6. yaklaşık olarak 1 ug / ml ya da daha yüksek bir konsantrasyonda örnek enjekte edilir. büyük hacimli içinde çözülmüş numuneler sütunun du dengede değiştirebilecekAlt tutma halka yükleme ve kurşun.
7. şöyle programlanmıştır gradyanı çalıştırın: 0 ila% 30 B 1 dakika içinde, 90 dakika içinde% 30 ile 60 B ve 1 dakika içinde 60 ila% 90, b.
8. Otomatik bir kısım toplayıcısı kullanılarak ve 1 dakika aralıklarla (Şekil 2'de gösterilen örnek kromatogram) fraksiyonları toplayın. tüm birimi içeren uygun boyutta tüplerde kesirler toplayın.
9. Bir vakum konsantratör kısımlara örnekleri kurulayın.
   Not: Geçici durma noktası: Kurutulmuş histon fraksiyonları kısa süreler için oda sıcaklığında muhafaza edilebilir - uzun vadeli süreler için (1 2 gün) ya da -80 ° C derin dondurucuda.

Aşağıdan yukarıya Analiz propiyonik anhidrit kullanılması histon 6. Kimyasal türetme

1. 50 mM NH ₄ HCO ₃ 40 ul histon örnekleri çözülür, pH 8.0 (tavsiye edilen miktar: 50 - 100 ug). Numuneler, saf GKD ₂ O olsaydı, 50 mM, pH 8 yapmak için _{NH4 HCO3} konsantre ekleyin.0.
2. Örnek kaybı olmaksızın pH indikatör şeritleri kullanarak pH'ı kontrol etmek için numune içine P10 pipet ıslatın. _NH4OH ve formik asit 8.0 pH ayarlamak için kullanılabilir.
   Not: Protokol aşağıdaki kısmı (6.3 adımlar - 6.7) reaktif propiyonik anhidrit tutmak için, en fazla üç dört numune gruplar halinde yapılmalıdır.
3. propiyonik anhidrit kullanılan sonraki adımlar için davlumbaz kullanın. 1 oranında asetonitril ile propiyonik anhidrit karıştırılmasıyla taze propionylation reaktifi hazırlayın: 3 (v / v). 1'de örnek propionylation reaktif: 4 (h / h). 40 ul histon için, 10 ul propionylation reaktifmi.
   Not: aşamada beyaz enkaz gözlemlemek mümkündür. Bununla birlikte, bu çok tuzlan ve propiyonik asit ihtiva eder ve bu nedenle özel bir işlem alınması gerekir.
4. Hızlı bir şekilde çözeltiye yeniden tesis pH 8.0 _NH4OH ekleyin. Not: peptidlerin serbest aminler ile reaksiyona Propiyonik anhidrit pervane üretirpH azalır -propiyonik asit. Genellikle, 1 bir oranı ile, örnek _NH4OH eklenerek: 5 (v / v) yeniden tesis pH 8.0 uygundur; örneğin, örnek 40 ul _NH4OH 8 ul.
5. vorteks hemen karıştırın.
6. Adım 6.2 ile aynı prosedüre pH'ı kontrol edin.
   Dikkat: pH 10.0 daha büyük olduğu zaman, daha yüksek bir pKa'ya sahip olan başka amino asit kalıntısı elde etiketlenmesi mümkündür.
7. 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
8. kesinlikle propionylation reaktif toplu iş başına en fazla 3 ya da 4 numuneler için reaksiyonu gerçekleştirerek, 6,7 - Tekrar 6.3 adımları tekrarlayın.
9. Bir vakum konsantratör 20 ul - aşağı 10 Kuru örnekler. Bu _NH4OH serbest, reaksiyona girmemiş propionik anhidrid, asetonitril, asetik asit ve amonyak gazı buharlaşır. Numuneler tamamen kurumasına ise, anlamlı bir örnek kayıpları meydana gelir.
   Not: İzopropanol yerine asetonitril kullanılabilir. Bununla birlikte, asetonitril böylece daha düşük bir yüzey gerilimi vardır vehızlı buharlaşma.
10. GKD ₂ O süspanse veya seyreltik örnekleri nihai hacim 40 ul elde edilene kadar.
11. Tekrarlayın 6.2 Basamaklar - 6.9. histon propionylation bir çift yuvarlak reaksiyon tamamlanma>% 95 sağlar.
12. şişede nem ile temas halinde asetik asit oluşumunu önlemek için argon gazı ile propiyonik anhidrid şişe doldurun.
    Not: Ara durma noktası: Örnek GKD _2, O ya da kurutuldu içinde yeniden -80 ° C'de saklanabilir.

Tripsin 7. Proteolitik sindirim

1. 50 mM _{NH4 HCO3} yeniden süspanse histonlar 1 ug / ml ya da daha yüksek bir optimal konsantrasyonunu elde etmek. Daha seyreltilmiş numuneler tripsin verimliliğini düşürmek yol açar.
   Not: Bu aşamada histon hala asidik, sonra NH'yi pipet ucu kullanarak örnek ₄ HCO ₃ tuz eklerseniz pH 8.0 olması gerekir.
2. 1:10 oranında (ağırlık / ağırlık) olarak histon örnekleri tripsin ekleyin.
3. doğmuş iyileşmesini8 saat - 6, 37 ° C 'de te.
4. -80 ° C donma sindirim durdurun.
5. Bir vakum konsantratör 20 ul - 10 numuneyi kurulayın.
   Not: Geçici durma noktası: Örnek -80 ° C saklanabilir.

N-istasyonlarında tamamıyla aynı Histon Peptidlerin 8. Propionylation

Not: Bu bölüm, tripsin özeti üretilen peptit N-uçlarının türetme açıklanmaktadır. Propionil grubu gibi peptid hidrofobikliğini artırır - Bu prosedür, kısa peptidler (histon H3 8, örneğin amino asit 3) HPLC tutma geliştirir.

1. 100 mM NH ₄ HCO ₃ 30 ul süspanse _örnekleri.
2. Tekrarlayın 6.1 Basamaklar - 6.9.
   Not: Vakum numunelerin kuruma bu aşamada uzun bir zaman alır normaldir.
3. Süspanse ya da 50 olan numune seyreltik - 100 ul GKD ₂ O + ya% 0.1 TFA ya da% 0.5 asetik asit elde edildi. Not: Asetik asit TFA facilitat olarak, uzun depoları için tavsiye edilirUzun vadede metionin oksidasyon es. TFA, daha iyi bir kromatografik tutma yardımcı olarak sahne-devrilme (bölüm 9), aynı gün yapılır Öte yandan, TFA tavsiye edilir.
   Not: Geçici durma noktası: Örnek -80 ° C saklanabilir.

Sahne ipuçları 9. Numune Tuzdan arındırma

Not: Bu aşamada, numunede tuzu bulunmaz. Onlar peptitler sinyali baskılayarak, elektrosprey sırasında iyonize çünkü tuzlar HPLC-MS analizi engellemektedir. Tuzlar ayrıca sigara yaklaştırılmış peptid için sinyal yoğunluğu azaltarak, peptidler üzerinde iyonik yaklaşımları oluşturmak olabilir. yaklaştırılmış peptid farklı kütleye sahip olacaktır gibi, peptit doğru tespit ya da mıktarı edilmez.

1. Bir P1000 pipet kullanarak, bir katı faz ekstraksiyon diskten C ₁₈ malzemeden bir disk yumruk. erimiş silika kılcal kullanarak P1000 ucu dışarı MiniDisk itin ve bir P100 / 200 pipet altına MiniDisk mevduat. d emin olunISK güvenli ucu (Şekil 3) alt kısmında sıkıştırılmıştır.
   Not: P1000 ucu C ₁₈ diski yumruk oldukça küçük bir delik vardır. Daha büyük bir çapa sahip bir delik olması için uç son santimetre kesmek için uygundur.
2. Aynı P100 / P200 ucu iki C ₁₈ yumruklar kullanın tuzsuzlaştırma örnek ug üzerinde 25 ise.
3. 1.5 ml veya 2 ml mikrosantrifüj tüplerinde yerinde sahne ipuçları tutmak için bir santrifüj adaptörü kullanın. - (400 RCF 300) dönüşü yavaş kullanın çözücüler, normalde bir dakikadan az reçine geçer.
4. C ₁₈ malzemeyi etkinleştirmek ve potansiyel kirlilikler giderilmelidir% 100 asetonitril 50 ul iplik reçine yıkayın.
5. Yavaş santrifüjleme ile% 0.1 TFA içerisinde 80 ul yıkama Diski dengelenmesi.
6. pH 4.0 ya da asetik asit ile daha düşük numunesi asitler. Örnek kaybını en aza indirmek için, pH şeritler ile pH'ı kontrol edin. Yavaş santrifüj diske yük örneği.
7. YıkamaYavaş santrifüjleme ile% 0.1 TFA içerisinde 80 ul - 70 yıkama numune.
8. Yavaş santrifüjleme ile 70 ul% 75 asetonitril ve% 0.5 asetik asit ile yıkanması ile örnek Zehir. 1.5 ml bir tüp içinde örnek toplamak.
9. bir vakum yoğunlaştırıcısı Kuru örnek.
   Not: Geçici durma noktası: Örnek -80 ° C saklanabilir.

Histon Peptidlerin 10. analizi

Not: Geleneksel peptid analizinde yapıldığı gibi NLC-MS platformu kurulmalıdır. 200 kullanımı - duyarlılık ve istikrar arasında mükemmel bir denge olarak 300 NL akış kolonu (75 um İD, analitik sütun, _C18 parçacıklar) tavsiye edilir. MS edinme yöntemi hedefli taramalar ¹⁹ veya veri bağımsız toplama (DIA) ^20,21 Temsilcisi Sonuçlar ve Şekil 4'te tarif hem veri bağımlı edinme (DDA) bir kombinasyonu olabilir.

1. HPLC tamponlar hazırlamak - A:% 0.1 formik asitHPLC-grade su; B: HPLC-grade asetonitril içinde% 0.1 formik asit.
2. 0 ile% 30 tampon B, 30 dakika içinde, 30 ile bir sonraki 5 dakika boyunca% 100 B ve 8 dakika boyunca izokratik% 100 B'de aşağıdaki gibidir: HPLC metodunu. 10 dakika boyunca% 0 B 1 dakika içinde 100 0 ila% B gradyeni ve izokratik akış HPLC: Örnek yüklemeden önce otomatik kolon dengeleme için programlanan değilse, o zaman aşağıdakileri içerir. 300 nl / dak - 250 analiz akış hızını ayarlayın.
3. Gerçekleştirmek için MS iktisap yöntemi Program ya hedefli taramaları ¹⁹ veya DIA ^20,21 (Şekil 4) ile birlikte DDA. daha doğru ölçümünü sağlayan kromatografik tepe genelinde yeterli veri noktalarını sahip olmak için, MS görev döngüsü tam bir MS her ~ 2 sn tarama sağlar emin olun. Not: _C18 kromatografisi ile ortalama başlangıç ​​tepe genişliği, yukarıda tarif edilen kademeli için yaklaşık 30 saniyedir.
4. HPLC c üzerine yaklaşık 1 mikrogram örnek yükleolumn.
5. programlandığı şekilde HPLC-MS / MS yöntemi çalıştırın.
   Not: protokolde geliştirilen bireysel proteomik laboratuar yöntemi için uygun olacaktır herhangi optimum kurulum olarak, sütunlar, MS aletleri veya MS parametresi ayrıntıları özelliklerini önermiyoruz. histon peptidler geleneksel peptidler olarak ayrı beri proteomik laboratuvarları, onların optimize kurulum kullanmalıdır.

11. Veri Analizi

1. pik alan entegrasyonunu gerçekleştirmek için yazılım içine MS ham dosyalarını içe aktarın. Not: EpiProfile ²² tavsiye edilir, bu histon peptidler için optimize edildiği gibidir; kromatografik elüsyon tutulma süresi bilgisini kullanarak bilinen histon peptidlerin güvenilir pik alan çıkarma gerçekleştirir. Alternatif olarak, Skyline ²³ amacıyla başka ideal bir yazılım.
   1. bunun modifiye edilmiş formlarını tüm bu peptidin toplam alanı tarafından alana bölünmesi, belirli bir peptidin göreceli olarak hesaplanır. Not: keşif analy durumundasis Maskot modifiye histon peptidlerin spektrumları belirlemek için tavsiye edilir. Bu aracın performansı son zamanlarda ²⁴ tarif edilmiştir. proteomik için diğer tüm veritabanı arama motorları da kullanılabilir, fakat bizim testler üzerine daha düşük bir performans sağladı.

Sonuçlar

Bir örnek olarak, 200 ul hücre peletleri ile başlayan ve retinoik asit (RA), uyandırma olmadan insan embriyonik kök hücreleri (hESC), elde edilen histon analiz edilmiştir. hücre kültürü içinde RA varlığı ESC farklılaşmasına yol açar. histon peptidlerin birden LC-MS enjeksiyonları gerçekleştirmek için yeterli olandan daha fazla olan histon 100 ug ekstre edildi, - hücre peleti, yaklaşık olarak 50. Türetme, sindirim ve tuzunun alınması işlemlerinden sonra, numuneler bağlanmış mikroakışkan fiş ile yüksek performans sıvı nano kromatografi sistemi seri modda 75 mm x 15 cm _C18 kolonu (parçacık çapı 3 um, gözenek boyutu 300 A) üzerine yüklendi bir melez doğrusal tuzak dört kutuplu - Orbitrap kütle spektrometresi. MS alıcı DIA kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Buna paralel olarak, numuneler bir melez iyon tuzağı-Orbitrap kütle spektrometresine birleşik nano akış UHPLC kullanılarak DDA yöntemi ile analiz edildi (veriler gösterilmemiştir). İçindeher döngü, bir tam MS Orbitrap algılama 1.400 m / z, ^6. Sonra, veri bağımlı kazanç modu dinamik uygulandı 10 60000 AGC (m / z 200) ve bir çözünürlük 290 tarama aralığı ile gerçekleştirildi 30 saniye dışlama. MS / MS taramaları en yoğun olanlardan ana iyonları takip edildi. birine göre bir şarj durumu iyonlar MS / MS alınmadı. 2, m / z bir izolasyon penceresi kullanılmıştır. İyonlar% 35 çarpışma enerjisi ile çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) kullanılarak parçalandı. İyon tuzağı algılama 10 ⁴ AGC normal tarama aralığı modu ve normal tarama hızı ile kullanılmıştır.

Ham MS verileri, yani ²³ ve EpiProfile ²² Skyline, öncüsü ve fragmanı iyon kromatogramlar çıkarılması için yazılım benimseyerek analiz edildi. nedeniyle moral önceki bilgisine akıllı pik alan çıkarma entegre olarak EpiProfile, histon peptidler için optimize edilmiştirgelgit tutma süresi. Öte yandan, Skyline DIA analizleri için optimize edilmiştir ve bu nedenle görüntülenen DIA rakamları (Şekil 4 ve 5A) Bu yazılım ekran vardır. ekstre iyon kromatogramdan, eğri altındaki alan alınır ve bu, her bir peptidin bolluk tahmin etmek için kullanılır. Kromatografik tepe alanı [M + H] için hesaplanan ^+, [M + 2H] ²⁺ ve [M + 3H], aynı peptidin ³⁺ iyonları da çoğu durumda [M + 2H] olsa ²⁺ yaygın biçimiydi. Bu peptidin, belirli bir modifiye formda ham bolluk içerir. PTMS göreceli olarak elde etmek için, bir histon peptidin farklı tadil edilmiş biçimlerinin toplamı% 100 olarak kabul edilmiştir ve özellikle peptid bölge, tadil edilmiş biçimlerinin tümünde bu histon peptid için toplam alan ile bölünmesinin olduğu .

Histon peptidler va mevcutizobarik formların riety (Şekil 5). ICD, peptidler, örneğin, K18ac ve K23ac, sadece özel fragman iyonları izobarik türleri (Şekil 5A ve 5B) oranını belirlemek için kullanılır MS / MS düzeyinde ölçülebilir. Bu oran, iki tür arasında kromatografik tepe alanı ayırmak için kullanılır. DDA kullanırken bu peptidler bir standart DDA deneyinde meydana olmaz, hangi onların bütün elüsyon yoluyla parçalanması için seçilmiş olması gerekir, çünkü bu izobarik formlar, hedef kitle listesinde alındı. izobarik türlerin görece bolluğu ayrımı daha sonra parça iyonlarının çıkış profili izleyerek gerçekleştirilir. Öte yandan, satın alma DIA tipi herhangi bir içerme listesi gerektirmez. Ancak, satın alma yöntemi bu tür bilinmeyen modifiye edilmiş peptidler keşif engelleyebilecek ve böylece geleneksel veritabanı arama ile uyumlu değildir ve.

Lizin asetilasyonu (+ 42,011 Da) yüksek çözünürlüklü MS satın alma (> 30.000) kullanarak neredeyse izobarik trimethylation (+ 42,047 Da) ayırt edildi. Ayrıca, asetilasyon, daha sonra, ilgili trimethylated olanlardan daha asetillenmiş peptidlerin elüsyonu yol trimethylation daha hidrofobiktir. Aynı peptid modifiye edilmemiş bir şekilde bağlı lisin propionylated edilir olması nedeniyle, daha sonra çözülür. Özetle, tek değiştirilebilir site ile bir peptid için hidrofobiklik sırası di- ve trimethylated

farklılaşma (Şekil 6A ve 6B) için uyarıldığında HESC asetile peptidlerin açık bir azalma olduğunu göstermiştir. Önceki sonuçlar ayırt olanlar ²⁵ ile karşılaştırıldığında EKH yüksek asetilasyonunu belirtildiği gibi bu, şaşırtıcı değildirpluripotent kromatin genellikle hoşgörülü doğasını yansıtmaktadır. Histon H3 odaklanarak, 35 farklı değiştirilmiş formları (Şekil 6C) ölçüldü. Bununla birlikte, bu yaklaşım ile araştırılabilir tüm histon proteoforms 200'ün tüm histon varyantları ve az bulunan değişiklikleri (veriler gösterilmemiştir) da dahil olmak üzere, bulunmaktadır. Bunun yanı sıra, analiz (± standart sapmayı ifade eder) hata çubukları küçük boyutu ile kanıtlandığı gibi yüksek bir tekrarlanabilirliği teknik çoğaltır elde edilebileceğini göstermiştir. Birlikte ele alındığında, bu bölümde NLC-MS verileri kullanılarak histon modifiye edilmiş peptidler göreceli bolluk ayıklamak açıklamaktadır.

Şekil 1:. Aşağıdan yukarıya MS / MS Histon Analiz İş Akışı histon analizi için on adım her adım için gerekli zamanın bir tahmin de dahil olmak üzere, gösterilir. bölüm numarası yazının içinde mevcut olarak parantez içinde verilmiştir. Belirli bir varyantının son derece hassas analizine ihtiyaç olmadığı sürece çeşitli histon varyantları izole etmek için numune parçalaması açıklayan Bölüm 5, ihmal edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: histon Varyant fraksiyonasyonunda ve Coomassie Jel için Ters Fazlı Yüksek Akış LC (A) bozulmamış histon ayrımını temsil eden LC-UV kromatogramı.. Histon H3 varyantları elüsyon zamanına göre birbirlerinden ayırt edilebilir. Fraksiyonlar bir otomatik kısım toplayıcısı kullanılarak ve ya elle ya da toplanabilir. Histon arıtma üç kez tekrarlanmış olan (B), Coomassie jeli.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig2large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3:. P1000 pipet ile Tak Sahne devrilme Yapımı, bir katı faz ekstraksiyon disk (ikinci panel) C ₁₈ malzemeden yapılmış bir disk yumruk. küçük kılcal her türlü kullanarak küçük bir P100 / 200 pipet içine itilebilir böylece MiniDisk, ucu (orta panel) sopa olacak. Bu örnekte, 700 ml'lik bir dış çapı kaynaşık silika boru kullanılır. MiniDisk herhangi başka (son paneli) gidemez kadar P100 / 200 pipet altına itilmesi gerekir. Bu çok sayıda kopya için yeterli numune malzeme tutmak için yeterli kapasiteye sahip olduğu aşama ucu, histon tuzsuzlaştırma hazırdır. sa, 20 ug - Özellikle, bir MiniDisk 15 yetermple. Daha fazla örnek gerekiyorsa, çoklu diskler birbirlerine paketlenmiş olabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4:. DDA kullanırken DDA ve DIA Yöntemleri şematik bir temsilidir, MS tarama döngüsü yoğunluk ve yük durumuna göre, MS / MS parçalanması için ön-madde iyonlarının sıralı seçilmesiyle karakterize edilir. bir öncü iyon parçalanmış edildikten sonra MS daha az bol sinyalleri içine "kazmak", böylece aynı peptid tekrarlayan seçimini önlemek için bir dışlama listesine yerleştirilir. Bu satın alma yöntemi keşif modu için proteomikteki tercih edilen tekniktir. Niceleme belirlenen MS yanında belirli bir iyon tam tarama sinyal entegre edilerek elde edilir /MS spektrum. DIA, tüm m / z aralığı her tarama döngüsünde parçalanır. Bu yaklaşım, bulma modu için daha az uygun olan fakat tüm iyonlar, öncüler ve ürünleri kromatografik profili sağlar. Bu daha güvenli ölçümü ve izobarik formların ayrımcılığa yol açar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5: Isobaric Peptides miktarının histon analizinde genellikle bol iki izobarik peptidlerin (A) Örnek.. çıkarılan iyon kromatogramı onların habercisi kütlesi ve (yukarıda) göreceli izotop (XIC) aynıdır. Ancak, ürün iyonları XIC (aşağıda) iki İzobarik formların ayrımcılık için izin verir. Özellikle, sadece tek fragman iyonları bizi olmalıdıred. İki türlerin göreceli bolluk tahmin (kırmızı vurgulanmış) iki açıklanan peptidler için benzersiz fragman iyonları (B) Temsil. En az bir izobarik eşdeğer olan Homo sapiens yaygın olarak analiz peptitlerin (C) Liste için. Sıra listelenen histon peptitler gösterilir arasında. Varyantları , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6: ve Retinoik Asit Tedavisi olmadan İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Temsilcisi Sonuçlar (A) histon H3 peptid KQLATKAAR rölatif ölçümü - onun değiştirilmiş proteoforms tüm (aa 18 26).. göreceli bolluk% 100 (rel olarak tüm proteoforms kullanılarak tahmin edilmiştir. değiştirilmemiş peptid ative yüzdesi) gösterilen histon H3 peptid KSTGGKAPR (aa 9 (B) Bağıl miktar değil -. 17) (C) ve retinoik asit ile hücre tedavisi olmadan kanonik histon H3 için tespit edilen peptidlerin Bağıl bolluğu. Şekil verilen değişiklikler (>% 50) daha fazladır iki tedavinin içinde gösterir. Genel olarak, biz histon H3 asetillendirme hücre farklılaşmasının indüksiyonu üzerine lizin kalıntılarının çoğu azaldığını göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Çözüm #	kompozisyon
1	Nükleer Yalıtım tamponu (NIB) hazır aşağıdaki gibi hazırlandı ve -20 ° C de, 100 ml alikotları olarak dondurulmuş olarak saklanır; çözülmüş15 mM Tris, 60 mM KCI, 15 mM NaCI, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 250 mM sükroz: NIB birkaç hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir. tampon pH'ı HCI ile 7.5'e ayarlandı.
2	Proteaz inhibitörleri (tampon taze ilave kullanımdan önce) GKD 2 içinde 1 M ditiyotreitol (DTT), O (1,000x); GKD 2 O (400x) 200 mM AEBSF
3	fosfataz inhibitörleri (tampon taze ilave kullanımdan önce): 2.5 uM Mikrokistin% 100 etanol (500x)
4	HDAC inhibitörü (kullanımdan önce tampon taze ekleme): 5 M sodyum bütirat, pH 7.0 (500x) için NaOH ile 5 M butirik asit titrasyonu ile yapılan
5	NP-40 Alternatif: GKD 2 O içinde% 10 h / h
6	GKD 2 O 0.2 MH 2 SO 4
7	Trichloroacetic asit (TCA):% 100 w / GKD 2 O v
8	Aseton +% 0.1 hidroklorik asit (HCl):% 0.1 h / h HCI aseton

Tablo 1. Çözümler.

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol maliyetleri, zaman ve performans dikkate alınarak optimize edilmiştir. Diğer preparasyonlar da mümkündür, ancak bunlar, özellikle MS analizi ile bağlanması durumunda, sınırlamaları vardır. Örneğin, yüksek tuz ekstraksiyon protokolü histonlar ²⁶ yerine, TCA çökeltisi (bölüm 3) saflaştırmak için kullanılabilir. güçlü asit kullanmak değildir gibi yüksek tuz protokolü, özünde hafif olduğunu. Bu asit-labil PTMS koruyan ve TCA çökeltisi olarak, ekstre histonların verim artar diğer kromatin bağlayıcı proteinleri birlikte çökelir. Bununla birlikte, yüksek tuzlu ekstraksiyon HPLC-MS / MS çok konsantre tuzlu ihtiva eden numuneler yol açar. Tripsin inkübasyon süresi ve enzim / substrat oranı ²⁷ azaltılması veya sindirim enzim ^28-30 kadar argc kullanılarak, örneğin, - Alternatif bir preparasyonda, histon sindirim propionylation (8 Bölüm 6) olmadan gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, propiyonik anhidrid ile türetme, i önerilmektedirt iyi sıvı kromatografisi sırasında korunur daha hidrofobik peptitler oluşmasına sebep olur.

Kimyasal türetme, organik asit anhidritleri, çeşitli değerlendirilmiştir ve yararları kapsamlı ¹⁸ ele alındı. Bununla birlikte, propiyonik anhidrit verimliliği, minimize yan ürünleri ve gelişmiş peptid hidrofobisite arasında en iyi uzlaşma kanıtladı. Potansiyel olarak, propionik anhidrid izotopik olarak etiketli halde satın alınabilir; bu durum birden fazla numune karıştırma ve ağır etiketten kazandırılan farklı kitlelere dayanan MS düzeyinde onları ayırmak olasılığına çoklayıcı analiz sağlar. Ancak bu analiz, LC-MS kromatogramının artan karmaşıklığı yol açar ve her bir durum için enjekte edilebilir numune miktarını azaltır.

Bu bağlamda, protokol bazı kritik yönleri vurgulanmalıdır. Aşağıdaki CH gibi kullanılmalıdırnegatif sonuçlar elde edilmektedir halinde işlemi gerçekleştirmeden hataları bulmak için ecklist. İlk olarak, çekirdek yağış sonrası pelet dikkatlice NP-40 Alternatif (karıştırma esnasında kabarcıkların eksikliği fark) deterjan tamamen kaldırılması kadar (bölüm 2.10) olmadan ELVES ile yıkanmalıdır. bunu başaramayınca asitlerle histon çıkarma taviz verecek. İkinci olarak, TCA ile histon yağış (bölüm 3.9) aseton ile pelet yıkar sonra çok önemlidir. propionylation ve sindirim (bölüm 6.1) doğrudan yapılması halinde konsantre asit varlığı aşağıdaki adımı zarar verecektir. (Bölüm 5) gerçekleştirilir durumda histon ayrıştırmada değil sorunlu olacaktır. (- 6.7 bölüm 6.3) Üçüncü olarak, propionylation Reaksiyon hızlı bir şekilde gerçekleştirilir esastır. 4 ardışık numunelerin - Bunu yapmak için, en fazla 3 için aynı propionylation karışımı (propiyonik anhidrit + asetonitril) kullanmaktan kaçının. Ayrıca, pH tripsin sindirim (bölüm 7) en önemli yönüdür. değilse8.0 (7.5 - 8.5) etrafında sindirim etkisiz olacaktır. Numune bu aşamada propiyonik asit açısından zengin olacak gibi bu, olabilir. _NH4OH gerektiğinde kadar ilave edilebilir. Ayrıca, proteomik iş akışları aşina araştırmacılar için tripsin sindirimi sonlandırmak için numunesi asitler normal hissedeceksiniz. Aşağıdaki reaksiyon, örneğin, peptid N-uçlarının (bölüm 8.1) propionylation tehlikeye gibi bu yapılmamalıdır. Son olarak, aynı konuda, o değiştirilmemiş peptitler gerçekten değiştirilmemiş olmayan veri analizi için hatırlamak önemlidir; tüm serbest lizin kalıntıları ve N-termini propionylation (56,026 Da) tarafından işgal edilecektir. Bu durumda, Peptid sekansına sadece karşı kitle çıkarma iyon kromatografisi performanstan sonuçlara neden olacaktır.

yöntemin sınırlamaları gerçek ABUN ulaşmada önyargılar nedeniyle kısa peptid dizileri, birleştirici PTMS tespit yetersizlik çoğunlukla ilişkilidir veFarklı modifiye formlarda peptidler, farklı etkinliklerine sahip iyonize olabilir olması nedeniyle bir değişiklikten dans. Ilk konu orta-down ya da ⁽¹⁶ gözden) yukarıdan aşağıya bir yaklaşımla bu tekniği birleştirerek çözülebilir. bile teknik olarak daha zor, Bu tip analiz, modifikasyon birlikte varlığı frekanslarını çalışmak için idealdir. Ayrıca, bazı peptitler, farklı histon türevleri aynı sekansa sahip yana zaman tabandan yukarı elde edilemez histon varyantları, daha iyi ayırt edilmesini sağlar. Iyonlaşma verimliliği ile ilgili ikinci mesele, sentetik peptidler ³¹ bir kütüphane kullanılarak çözülebilir. Bu yaklaşım, histon PTMS görece bolluğu daha doğru bir tahmin sağlar. Ancak, çoğu deneylerde, istenen sonucu analiz koşulları arasında verilen değişiklikler göreli değişikliklerdir. Bu durumda, böyle bir korelasyon nedeniyle parçaların aynı Bia sahip olması gerekli değildir,s.

Sonuç olarak, bu protokol tandem MS bağlanmış NLC kullanarak 3 gün içinde tamamlanabilir histon PTMS analizi için izin verir. MS dışındaki teknikleri ile yapılan karşılaştırmalar, yani onlar hacmi bile neredeyse bu seviyeye ulaşmak olamaz girişte tartışıldığı gibi antikor bazlı stratejileri kullanarak, uygun değildir. Buna ek olarak, antikor tabanlı teknikler yeni değişiklikler keşfi için izin vermez, ama onlar sadece teyit ve tahmin işaretleri miktarının dayanmaktadır. Böylece ayar gen ekspresyonu kahramanları olan histon işaretleri, düzenlenmesi bilerek nedeniyle sezgisel avantajları proteomik laboratuarlarında popülerlik kazanmaya ve böylece proteom düzenlenmesini etkileyecek histon peptidler o aşağıdan yukarıya proteomik spekülasyon. Ayrıca, protokol açıklanan laborant için de histon analizi daha önemsiz hale veri analizi için numune hazırlama ve yazılım son gelişmeleri içerirhypermodified peptidlerin bu tür karakterizasyonu yaşamamış Tories.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypsin 0.25% EDTA	Invitrogen	25200056	For harvesting cells
PBS	Invitrogen	14200075
Tris	Roche	77-86-1
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Sodium Chloride	Sigma	S9888
Magnesium Chloride hexahydrate	Sigma	M9272
Calcium Chloride, anhydrous	Sigma	C1016
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
DTT	Invitrogen	15508-013
AEBSF	EMD Millipore Corp	101500
Microcystin	Sigma	M4194
Sodium Butyrate	Sigma	B5887
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)	Fisher Scientific	78445
NP- 40 Alternative	CALBIOCHEM	492016
Sulfuric Acid, ACS grade	Fisher Chemical	7664-93-9
Trichloroacetic acid	Sigma	T6399
Acetone	Sigma	179124
HCl	Fisher Chemical	A144-500
Bradford reagent	Biorad	500-0006
30% acrylamide/bis 29:1 — 500 ml	Biorad	1610156
Coomassie	Fisher Scientific	20278
C18 Column (5 µm) 2.1 mm x 250 mm	Grace	218TP52
C18 Column (5 µm) 4.6 mm x 250 mm	Grace	218TP54
HPLC grade acetonitrile	Fisher Chemical	A955-4
HPLC grade water	Fisher Scientific	W6 4
TFA	Fisher Scientific	A11650
Ammonium Bicarbonate	Sigma	A6141
ammonium hydroxide	Sigma	338818
propionic anhydride	Sigma	240311
Sequencing grade modified trypsin	Promega	PRV5113	For digesting histones for MS
Acetic Acid	Sigma	49199
C18 extraction disk	Empore	2215
Formic Acid	Sigma	F0507