Método rápido y simplificado para el aislamiento alto rendimiento de procesamiento de miRNA desde muy puras lipoproteína de alta densidad

Resumen

MicroARNs juegan un importante papel regulador y están surgiendo como nuevas dianas terapéuticas para diversas enfermedades humanas. Se ha demostrado que miRNAs se realizan en las lipoproteínas de alta densidad. Hemos desarrollado un método simplificado para aislar rápidamente HDL purificado adecuado para el análisis de los genes miARN partir de plasma humano.

Resumen

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

Introducción

MicroRNAs are endogenous non-coding tiny RNA species that are highly conserved and are considered key players in the regulation of various biological processes by degrading or repressing specific target messenger RNAs¹. Because miRNAs act intracellularly they have been explored as tissue-derived biomarkers which led to the discovery of tissue-specific functions of these miRNA. However, miRNAs are also found extracellularly either associated with proteins or in exosomes/micro vesicles that effectively can shield them from degradation by extracellular RNases². More recent studies have shown that the protective effect of HDL may not be closely linked to its capability to promote cholesterol efflux but rather to its non-cholesterol cargo, in particularly as a circulating miRNAs carrier ^{3, 4}. These miRNAs may not only modulate lipid metabolism but are also associated with anti-inflammatory, antioxidant and antithrombotic effects of the HDL-miRNA complex ^{5, 6}.

To further explore the role of miRNAs carried in HDL particles, a simple and easy protocol needs to be established for miRNA extraction from isolated highly purified HDL for use in clinical routine. Numerous methods have been described to isolate HDL. These methods are either very time consuming or require large volume of plasma that may require sample pooling, extensive dialysis for desalting isolated lipoproteins and they do not completely remove exosomes as a source of miRNAs³, respectively. Here we describe a simple and rapid method that can isolate miRNA from highly purified HDL utilizing small volume of blood samples on a larger scale. We believe that this method may serve as good reference to promote research into the role of circulating miRNAs and in particular the role of HDL in facilitating communication between various cells and organs.

Protocolo

1. Recolección de Muestras de Sangre

1. Recoger el ayuno muestras de sangre venosa periférica en tubos de 10 ml de plástico que contienen ácido anticoagulante etilendiaminotetraacético (EDTA) (que tiene varias ventajas sobre otros anticoagulantes) por punción venosa estándar de una vena prominente en la fosa antecubital.
2. Centrifugar las muestras de sangre a 1.600 xg durante 20 min a 4 ° C en una centrífuga de mesa para obtener plasma libre de células rojas de la sangre y pequeñas cantidades de ARN.
3. Secuencialmente centrifugar el sobrenadante a 3.000 g (4 ° C) en un cubo de rotor de balanceo por 10 min para eliminar WBC y plaquetas y luego adicional 15 min para eliminar los desechos de células restante, respectivamente.
4. Medir la densidad del plasma utilizando un densitómetro a TA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   NOTA: El ajuste de la densidad (d = 1,023 g / ml) con solución salina al 0,9% puede ser necesaria después de la eliminación de los exosomas pero antes de la ultracentrifugación en gradiente de densidad.

2. Eliminación de exosoma de Plasma

1. Retire los exosomas circulantes que tienen una densidad similar a la HDL y representan una fuente cuantitativamente significativo de miARN ^3.
   1. Para ello, agregue 252 l solución de precipitación exosome a 1 ml de plasma seguido de incubación durante 30 min a 4 ° C. Para sedimentar los exosomas, centrifugar la mezcla durante 30 minutos a 1500 g a 4 ° C.
   2. Para aislar HDL, la transferencia de 1 ml del sobrenadante resultante a un tubo de ultracentrífuga de policarbonato de paredes gruesas para su procesamiento posterior con la ultracentrifugación en gradiente de densidad (véase más adelante).

3. La ultracentrifugación en gradiente de densidad (Figura 1).

1. Para separar HDL utilizar un proceso de 3 pasos empleando una ultracentrífuga suelo con un rotor de ángulo fijo que opera a 448.811 x G y 8 ° C, respectivamente.
2. Preparar tres soluciones diferentes de densidad secuencialmente y fresco para cada aislamiento.
   1. Preparar la solución A (aislamiento de VLDL, d = 1,006 g / ml) mediante la disolución de 11,4 g de NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na y 1 ml de NaOH 1 N en 1.000 ml de agua destilada-autoclave. A continuación, añadir un adicional de 3 ml de agua destilada en autoclave.
   2. Preparar la solución B (aislamiento de LDL, d = 1,182 g / ml) mediante la adición de 25,2 g de NaBr a 100 ml de solución A (NaCl 0,195 mol, NaBr 2,44 mol).
   3. Preparar la solución de C (aislamiento de HDL, d = 1,470 g / ml) mediante la mezcla de 78,8 g de NaBr con 100 ml de solución A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Confirmar la densidad adecuada a temperatura ambiente usando un densitómetro. Mantenga todas las soluciones a 4 ° C hasta su uso posterior.

4. Aislamiento de VLDL

1. Mezclar 1 ml de plasma (densidad media = 1.023 g / ml) y nucleasa libre 200 l de Fat Red 7B en un tubo de ultracentrífuga de pared gruesa 6,5 ​​ml de policarbonato.
2. A continuación, la capa cuidadosamente 5 ml de la solución A en la parte superior de la mezcla. Si es necesario, añadir grasa adicional Red 7B en la parte superior de la solución A to equilibrar el peso de cada tubo. Centrifugar durante 2 horas (aceleración - 5), (deceleración - 7).
   NOTA: Durante la centrifugación, las lipoproteínas se acumulan como una banda en sus regiones de densidad de equilibrio.
3. Al final de la carrera observar 2 capas. Retirar 1,5 ml de la fracción VLDL que representa la capa superior y se almacena a 4 ° C.
4. Finalmente, utilizando una pipeta de transferencia 4 ml de la parte inferior del tubo que contiene el LDL, HDL, la albúmina y la fracción de ácido graso a un nuevo tubo de policarbonato para el aislamiento de LDL.

5. Aislamiento de LDL

1. Mezclar 2 ml de la solución B y 100 l de nucleasa libre de grasa Red 7B en el tubo que contiene la fracción LDL y HDL (sección 4), respectivamente.
2. Centrifugar a cabo durante 3 horas (aceleración 9, deceleración 7). A partir de entonces, retirar 1,5 ml de la fracción LDL que representa la capa superior y mantener a 4 ° C o almacenar a -80 ° C. Finalmente, la transferencia de 4 ml de la parte inferior del tubo que contiene la HDLfracción a un nuevo tubo de policarbonato.

6. Aislamiento de HDL

1. Mezclar 2 ml de la solución C, 100 nucleasa l libre Fat Red 7B y 15 l de 98% β-mercaptoetanol en el tubo que contiene la fracción HDL, respectivamente.
2. Centrifugar durante 3 horas (aceleración 9, deceleración 7). A partir de entonces retire 2 ml de la fracción HDL representan la capa superior y, o bien mantener a 4 ° C o almacenar a -80 ° C.

7. La desalación y concentración de la lipoproteína de fracciones

1. Para evitar la interferencia con la electroforesis en gel de agarosa posterior y PCR, eliminar el exceso de sal añadida durante la ultracentrifugación en gradiente de densidad usando dispositivos de filtro centrífugos con el corte de peso molecular apropiado (tubo 3K para VLDL y el tubo de 10K para LDL / HDL) como se describe por las instrucciones del fabricante.
   1. En pocas palabras, después de la adición de 2,5 ml de PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 2 mM; pH 7,4) frío centrifuge toda la fracción VLDL recogió-durante ultracentrifugación en gradiente de densidad a 4 ° C durante 60 min usando un rotor de cubeta oscilante.
   2. Desalar la fracción LDL dos veces con 10 ml de PBS enfriado en hielo durante 30 minutos cada uno. A continuación, utilizar 13 ml de PBS helado dos veces para la desalación de la fracción HDL. El volumen de PBS más alto es necesario para mejorar la movilidad con electroforesis en gel de agarosa. Después de la centrifugación, eliminar los solutos que contienen lipoproteínas y mantenerse a 4 ° C o se almacena a -80 ° C.

8. gel de agarosa La electroforesis

1. Perfrom electroforesis en gel de agarosa empleando el kit de lipoproteínas con modificaciones menores de las instrucciones del fabricante de la siguiente manera.
   NOTA: Este paso es sólo para evaluar la calidad y la pureza de las muestras concentradas de lipoproteínas.
   1. En pocas palabras, obtener 6 l de la fracción de lipoproteínas de desalado con ultracentrifugación en gradiente de densidad y cargar en un gel de lipoproteína pre-cast. Utilice LipoP humanarotein normas de VLDL, LDL y HDL como referencia de tamaño. Llevar a cabo la electroforesis a temperatura ambiente a 100 V durante 60 minutos usando tampón Rep Prep.
   2. Secar el gel durante 10 min y luego manchar durante 10 min a RT con Fat Red 7B. Destain el gel en una mezcla de metanol-agua 75:25 (v / v) y se seca de nuevo por 5 min.

9. RNA Extracción y Purificación

1. Perfrom aislamiento de los genes miARN HDL humano purificado utilizando el kit de suero / plasma de aislamiento y purificación de miRNA.
   1. En pocas palabras, añadir 1 ml de reactivo de lisis de ARN de 200 l de HDL purificada, se mezcla con un vórtice y luego se incubaron durante 5 min a RT para asegurar la disociación completa de los complejos de nucleoproteína y la inactivación de las RNasas.
   2. Entonces pico de 3,5 l de Caenorhabditis Elegans sintética microARN (miR-cel-39, 1,6 x 10 ⁸ copias / l) en la mezcla. A continuación, llevar a cabo la extracción de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. realizar Purificatien extraída de los genes miARN con columnas de centrifugación eluir según las instrucciones del fabricante. Medir la concentración de miARN de HDL purificada con un spectrophorometer.
   NOTA: La elución de miRNA de las columnas de centrifugación empleó 16 l de agua libre de RNasa.

10. transcripción inversa (RT-PCR)

1. Aislar 100 ng de los genes miARN de HDL enriquecida con los genes miARN sintético (cel-miR-39) y a transcripción inversa en un volumen de reacción de 20 l que emplea el kit de transcripción inversa y de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Realizar controles apropiados sin plantilla miRNA (NTC) y sin mezcla de enzima transcriptasa inversa (NRT).

11.-PCR en tiempo real (QRT-PCR)

1. Perfrom PCR en tiempo real en un volumen total de 20 l con 2 l de una dilución 1: 2 del ADNc, 10 l de la mezcla PCR, 2 l cebador universal, 2 l de cebadores miARN y 4 l de agua libre de RNasa.
2. Ejecutar los reactien en placas de 96 pocillos a 95 ° C durante 15 min, seguido de 45 ciclos de 94 ° C durante 15 segundos y 55 ° C durante 30 s y una fase de extensión a 70 ° C durante 30 s.ec perfrom todas las reacciones por triplicado .
3. A continuación, calcuate cantidades relativas de los genes miARN utilizando el método 2 ^-ΔΔ Ct después de la normalización para la limpieza de genes sintética según las instrucciones del fabricante.

Resultados

Aislamiento de lipoproteína de alta densidad después de eliminar las exosomas
Para obtener los genes miARN de HDL altamente purificada es necesario para eliminar los exosomas que representan una fuente de contaminación miRNA ^7. Esto se hizo antes de la ultracentrifugación en gradiente de densidad con un kit disponible en el mercado. Para fines prácticos un protocolo de ultracentrifugación en gradiente de densidad estándar de tres...

Discusión

Identificación de nuevos biomarcadores de la sangre será ayudar en el diagnóstico clínico y el pronóstico de diversas enfermedades. Los microARN han sabe que poseen todas las cualidades de biomarcadores y se ha demostrado en diversos estudios ^14-17. En este estudio hemos demostrado método fácil rápido y sencillo para aislar los genes miARN de HDL plasma. Densidad convencional gradiente método de ultra-centrifugación de aislamiento de VLDL, LDL y HDL depende de muestreo preciso de plasma, una prepara...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes	Becton, Dickinson and Company	366643
Centrifuge	Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R	75004261
Densito 30PX densitometer	Mettler Toledo	MT51324450
ExoQuick solution	Invitrogen	4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube	Thermo Scientific	O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge	Thermo Scientific	46902
Fat Red 7B	Sigma-Aldrich	201618
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K	Millipore	UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K	Millipore	UFC800308
QuickGel Lipo kit	Helena Laboratories	3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL	LipoTrol; Helena Laboratories	5069
Rep Prep buffer	Helena Laboratories	3100
RNeasy MinElute spin columns	Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer	Thermo Scientific
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system	BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit	QIAGEN	217184
miScript Primer Assays	QIAGEN	141078139
miScript SYBR Green PCR Kit	QIAGEN	218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control	QIAGEN	219610
NaOH	SIGMA-ALDRICH	480878
0.20 µM sterile syringe filter	SIGMA-ALDRICH	Z227536