Confronto di tre diversi metodi per la determinazione proliferazione cellulare in Breast Cancer linee cellulari

Riepilogo

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Abstract

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

Introduzione

Il gene soppressore del tumore, p53, è un regolatore essenziale di un certo numero di processi cellulari, tra cui l'arresto del ciclo cellulare, apoptosi e senescenza ^1. E 'responsabile del mantenimento della stabilità genomica, ed è quindi fondamentale per mantenere l'equilibrio di morte cellulare e la crescita delle cellule. Le mutazioni nel p53 sono comuni nel cancro e sono la principale causa di p53 l'inattivazione porta al cancro incontrollata proliferazione cellulare ^2. È interessante notare che mutazioni in p53 rappresentano solo circa il 25% dei tumori al seno ^3, suggerendo che altri meccanismi sono responsabili per la perdita della funzione di p53. Le isoforme p53 recentemente scoperte hanno dimostrato di essere sovraespresso in un certo numero di tumori umani, e possono modulare la funzione p53 ^4,5. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'isoforma p53, Δ40p53, è l'isoforma più altamente espresso nel cancro al seno, ed è significativamente upregulated in cellule del cancro al seno, rispetto al normale tiss adiacenteue ^6. A seguito di questo, abbiamo stabilmente trasdotto linea di cellule di cancro al seno umano MCF-7 per iperespressione Δ40p53 con il Lego-IG2-puro + vettore (GFP +) ^7. Queste cellule sono stati usati per indagare se elevata espressione Δ40p53 aumenta i tassi di proliferazione cellulare in cellule di cancro al seno.

Ci sono molti metodi diretti e indiretti di misurazione proliferazione cellulare di cellule coltivate in vitro ^8,9. Questi possono essere eseguite sia come misurazioni in continuo nel tempo, o saggi come endpoint ^10. I metodi convenzionali sono ancora utili, come ad esempio il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro. Questo test è un basso costo e la misura diretta del numero di cellulare, ma non si basano su grandi conta delle cellule e la formazione altamente qualificata per ridurre al minimo errore e di grandi dimensioni standard di scostamenti dalle conta. La necessità di effettuare misurazioni compatibili con formati ad elevata capacità ha portato allo sviluppo di saggi multipozzetto-piastra. Questi test di luminescenza a base di misure il numero di cellule in base a un segnale di luminescenza che è proporzionale all'attività metabolica delle cellule ^11,12. Più recentemente, l'introduzione di piattaforme di imaging ad alto contenuto ha consentito di nuovi strumenti che controllano la proliferazione cellulare, fornendo raccolta dati fenotipica quantitativa e qualitativa, e comprende una varietà di sistemi ^13. Tutti questi metodi forniscono vie per misurare la crescita delle cellule, mediante saggi di misura o endpoint continue, e ciascuno possiedono una serie di vantaggi e svantaggi per quanto riguarda la sensibilità, throughput numero di campioni, e informazioni di cellule, ciascuno dei quali può essere pesato conseguenza seconda sulla domanda di ricerca.

Questo protocollo descrive tre metodi diversi per misurare la proliferazione cellulare in vitro, con ogni metodo utilizzando diverse gamme di sensibilità, riproducibilità e formati lastra multi-pozzetto. Questo protocollo prova a confrontare l'uso di un cha conteggio emocitometromber, un saggio luminescenza basato vitalità cellulare, e imager cellulare, nella misurazione della proliferazione cellulare su un corso di tempo 96 ore. Per fare questo, la crescita delle cellule trasdotte vettori (MCF-7-Lego) è stato confrontato con cellule trasdotte la sovraespressione Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), utilizzando tre diverse densità di cellule. La proliferazione cellulare è stata misurata ogni 24 ore per un massimo di 96 ore. Ogni metodo ha dimostrato di avere i propri vantaggi e svantaggi, e in funzione dello scopo dell'esperimento, ognuno ancora è un metodo utile per fornire informazioni sul tasso di proliferazione.

Protocollo

1. Le cellule Preparazione per la proliferazione Assays

Nota: Preparare due linee cellulari nello stesso modo e sementi nello stesso formato per ciascun metodo da analizzare.

1. Grow MCF-7-Lego e MCF-7-Δ40p53 ⁷ celle al 75-80% di confluenza nel T 75 cm ² di tessuto fiasche di coltura usando fenolo-rosso libero di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) , 200 mM L-glutammina, 2 ug / ml di insulina e 1 mg / ml puromicina a 37 ° C con 5% di CO _2. Maneggiare le celle di una sicurezza biologica sterile armadietto di classe II.
   Nota: La quantità di tempo necessario per crescere le cellule a confluenza varia a seconda della diluizione semina. In preparazione per la placcatura le cellule per i saggi di proliferazione, seminare le cellule a una diluizione 1: 3 integrato DMEM e mantenere in condizioni di crescita normali per 3 giorni fino a 75-80% di confluenza.
2. Per rimuovere le cellule dal pallone, versare fuori i media inun contenitore per rifiuti. Lavare immediatamente lo strato di cellule con 2 ml di tripsina 2x pre-riscaldato. Aspirare tripsina. Aggiungere altri 2 ml di tripsina preriscaldata al livello cellulare e posto in un incubatore per 5 min a 37 ° C con 5% di CO _2.
   1. Una volta che le cellule si staccano, lavare le cellule con 10 ml riscaldato fresco integrati DMEM. Trasferire la sospensione cellulare ad una sterile tubo 15 ml e centrifugare a 491 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Con attenzione aspirare e smaltire il surnatante.
3. Risospendere il pellet di cellule in 5 ml di fresco INTEGRAZIONI DMEM. Eseguire un numero di celle per determinare la densità giusta per seminare le cellule in piastre da 96 pozzetti.
   1. Diluire 100 ml di sospensione di cellule in 900 ml di 1x Dulbecco tampone fosfato (DPBS). Posizionare un nuovo sensore 60 micron sul bancone delle cellule automatizzato. Tenere premuto il pistone e immergere il sensore nella sospensione cellulare diluita. Rilasciare lentamente lo stantuffo sul bancone cellulare. Rimuovere il sensore dalla cella di counter una volta completato.
      Nota: Il numero di celle viene visualizzato sul contatore delle cellule in cellule / ml.
4. Cellule seme in un volume finale di 100 microlitri (in DMEM) in una piastra a 96 pozzetti a ~ 20% di confluenza di consentire camera per la crescita cellulare e la misurazione della proliferazione in 3-5 giorni (vedi Tabella 1). Seed tutte le linee cellulari in triplice copia.
   Nota: Per questo esperimento, tre diverse densità di cellule sono state valutate per determinare la densità cellulare ottimale. I numeri di cellule necessarie sono riassunti nella Tabella 1. Le cellule Seed ad una densità inferiore se è richiesta la misurazione di crescita più lungo termine.
   1. Per l'emocitometro e saggi luminescenza-based, preparare un piatto per ogni punto di tempo (vale a dire 4 piastre per test). Per il saggio imager cellule, solo preparare una piastra per la durata dell'esperimento.
5. Mantenere le cellule a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 24 ore.

2. Determinazione conte delle cellule USing un emocitometro

1. Pre-calda sia medio e tripsina a 37 ° C in un incubatore di coltura cellulare, forno o bagnomaria. supporti Aspirare da cellule in un contenitore per rifiuti, lavare una volta con 30 ml di tripsina 2x, e aspirare la tripsina.
2. Lavare le cellule di nuovo con 30 ml di tripsina 2x, e incubare per 5 minuti a 37 ° C. Battere delicatamente bordo della piastra per rimuovere le cellule dalla piastra. Aggiungere 50 ml di DMEM integrato e mescolare le cellule pipettando fino a quando le cellule formano una sospensione singola cella.
3. Preparare emocitometro per metri quadrati e copertura in vetro di pulizia con il 70% di etanolo.
4. Posizionare il vetro di copertura antiscivolo su camere di conteggio e apporre fino a quando può essere visto 'anelli di rifrazione di Newton' tra i bordi di copertura antiscivolo e l'emocitometro.
   Nota: Queste indicano che la copertura antiscivolo ha correttamente aderito alla emocitometro.
5. pipetta delicatamente 20 ml di sospensione cellulare sotto la copertura antiscivolo, riempiendo la camera di conteggio dal movimento capillare.Mettere emocitometro a 10 ingrandimenti di un microscopio e visualizzare le camere di conteggio nel layout a griglia.
6. Contare le celle nelle 4 caselle esterne del layout della griglia. Per migliorare la precisione, ripetere i conteggi delle piazze esterne aggiuntivo, se necessario, o fino a quando il conteggio ha raggiunto 70 - 100 cellule ^14,15.
   1. Calcolare la concentrazione delle cellule per ml come segue: numero medio di cellule per il fattore di diluizione quadrato x (se utilizzato) x 10 ⁴
7. Ripetere i passaggi 2,1-2,8 ogni 24 ore per 96 ore post-semina.

3. Determinare la proliferazione delle cellule usando un test a base di luminescenza

Nota: Questa è una misura endpoint. Una volta che il reagente viene aggiunto alle cellule, la piastra può essere quantificato solo una volta.

1. Scongelare reagente luminescenza a bagnomaria C 22 ° per 30 min.
2. Mescolare delicatamente il reagente capovolgendo il flacone per ottenere un impasto omogeneo.
3. Equilibrare un piatto di cellule seminate (dal punto1.5) a temperatura ambiente per 30 min.
4. Aggiungere 100 ml di reagente di luminescenza per ogni pozzetto. Mescolare il contenuto su un agitatore orbitale per 2 minuti. Lasciare piastra per incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
5. Impostazione di un esperimento di luminescenza utilizzando il software lettore di piastre multi-mode.
   1. Accendere lettore di piastre multi-mode e aprire il software. Nel 'task manager', selezionare 'esperimenti' e 'creare new'.Select' file 'dalla barra degli strumenti laterale, e sotto' protocollo 'scheda, selezionare' procedura '.
   2. Seleziona 'Grenier 96 fondo piatto' del tipo a piastre, e selezionare la casella 'uso del coperchio'. Selezionare l'azione 'leggere' in scatola 'metodo di lettura'. Seleziona metodo di rilevazione 'luminescenza'. Fare clic su 'OK'.
   3. Nella casella fase di lettura, selezionare i pozzi da sottoporre a scansione nella scheda 'piatto pieno', e selezionare i pozzi di agire come pozzi vuoti.
   4. Impostare il filtro impostato filtro vuoto (ad esempio, la spina, Em: il foro, specchio: nessuno). Impostare il guadagno135, con un tempo di integrazione di 0,5 sec per pozzetto e un'altezza lettura di 6,5 mm. Fare clic su 'OK' per salvare le impostazioni per la lettura luminescenza.
6. Esecuzione di un luminescenti Leggi
   1. Espellere portatarga selezionando scheda 'il controllo dello strumento' e cliccare su 'piatto out'.Place piastra a 96 pozzetti sul portatarga, assicurando il coperchio è acceso. Chiudere il portatarga cliccando su 'piatto in' scheda sotto 'controllo dello strumento'. Clicca su 'leggere la società' dalla barra degli strumenti per eseguire la lettura luminescenti.
   2. Esportare le misure relative unità luminescente (RLU) per ogni bene ad un foglio di calcolo per ulteriori analisi.
7. Ripetere i passaggi 3,1-3,6 per registrare la proliferazione ogni 24 ore fino a 96 ore dopo la semina cellule.

4. Determinazione Cell Count Utilizzando un cellulare Imager

1. Impostazione di un esperimento di imaging cellulare utilizzando il software imager celle multi-mode
   1. Accendere imager cella multi-mode e aperto esimoe software.
   2. Nel 'task manager', selezionare la scheda 'esperimenti' e 'creare new'.On il' 'barra degli strumenti, fare clic su' file 'scheda e aperto' protocollo procedura di set 'tab.Select' temperatura azione '. Impostare incubatore per 'on' e impostare la temperatura a 37 ° C e verificare 'preriscaldamento' prima di continuare con scatola passo successivo '. Fare clic su 'OK' per salvare le impostazioni.
   3. Selezionare l'azione 'leggere'. Clicca sul metodo di rilevazione 'immagine', selezionare 'endpoint / cinetica' di leggere il tipo e il tipo di ottica 'filtri'. Fare clic su 'OK'.Click sulla' scheda piatto pieno 'e selezionare pozzetti sulla piastra di essere ripreso. Fare clic su 'OK' per salvare le impostazioni.
   4. Selezionare l'obiettivo 2.5X dal menu a tendina opzioni 'obiettivi'. Nella scheda 'canali', selezionare due canali: GFP 469, 525 e campo luminoso. Controllare l'esposizione 'auto' per entrambi i canali e selezionare bene l'auto-esposizione.
   5. Per determinare auto le impostazioni di messa a fuoco, selezionare 'auto-focus' e cliccare su 'opzioni'. Per le opzioni di auto-focus, selezionare il metodo di 'eseguire la scansione e poi messa a fuoco automatica'. Fare clic su 'OK' per salvare le impostazioni.
   6. Impostare l'orizzontale e l'offset dal centro di benessere (micron) verticale per 0.Select per acquisire più immagini per bene in un montaggio 3 x 2, con spaziatura orizzontale (micron) = 2.881 e spaziatura verticale (micron) = 2.127. Fare clic su 'OK' per salvare le impostazioni della procedura.
      Nota: Vedere la Tabella 2 per i parametri di lettura.
2. Esecuzione Leggi Esperimento sulla piastra selezionati
   1. Fare clic sulla scheda 'controllo dello strumento' e selezionare il 'piatto fuori' function.Place piastra da 96 pozzetti in portatarga, assicurando il coperchio è acceso. Nella scheda 'controllo dello strumento', selezionare il 'piatto in' funzione. Seleziona 'di leggere la società' dalla scheda piatto. Ripetere leggere ogni 24 ore fino a 96 ore post-semina.
3. Analisi del conte cella utilizzando ilCellulare Imager Software.
   1. Per analizzare un'immagine, fare clic sulla scheda '' i dati sulla lastra esposta, 'immagine [GFP 469, 525 + Campo chiaro]' selezionare. Fare doppio clic su una ripreso bene.
   2. Clicca su un'immagine caricata. Seleziona 'analizzare' per selezionare una singola immagine del montaggio da analizzare. Fare clic su 'OK'.Check il' GFP 'solo canale, e dei parametri impostati come indicato nella tabella 3. Fai clic su' Start 'per applicare i parametri alle cellule imaged.
   3. Osservare la maschera conteggio delle cellule posta sopra le celle imaged, che viene utilizzato per determinare il numero di cellule per immagine. Fare clic su 'applicare le modifiche' e mantenere queste impostazioni per ogni lastra esposta per tutto l'esperimento.
   4. Una volta tornati in lastra esposta, cliccare sul menù a 'dati' menu a tendina e selezionare 'conta delle cellule'. Questo genera il numero totale di cellule per pozzetto.
   5. Esportare tutti i dati in un foglio di calcolo, fare clic sulla scheda 'esportazione' per ulteriori analisi of i conteggi delle cellule per pozzetto.

Risultati

Per studiare diversi metodi di misura della proliferazione delle cellule in coltura, la proliferazione delle cellule di MCF-7-Δ40p53 cellule trasdotte stata confrontata alla non trasdotte MCF-7-Lego linea cellulare di tumore al seno. I tre metodi che sono stati confrontati - il metodo di imaging emocitometro convenzionale, test di luminescenza vitalità cellulare, e la cella analisi-sono illustrate nel diagramma schematico (figura 1). Ogni metodo presenta vantaggi e sva...

Discussione

In questo protocollo sono state esaminate tre diversi metodi di misurazione proliferazione delle cellule in cellule in coltura. Ogni metodo era capace di misurazioni riproducibili e precise di proliferazione cellulare su 96 ore, ei risultati erano confrontabili tra ciascuno dei metodi testati (Figura 2 e 3). Sia il test di luminescenza-based e metodo di imaging cellulare prodotto i risultati più robusti, mostrando incremento lineare nella proliferazione cellulare dopo 96 ore (Figura 2b,

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red	ThermoFisher Scientific	21063-045	Supplemented with 10% FBS, 200mM L-glutamine, 2µg/ml insulin and 1µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-081
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x)	ThermoFisher Scientific	15400-054	Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x)	ThermoFisher Scientific	30028-02
Tissue culture flask, 75cm2 growth area	Greiner Bio-One	658175
Scepter 2.0 Cell Counter	Merck Millipore		Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom	Nunc	167008
Improved Neubauer Hemocytometer	BOECO Germany	BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope	Olympus	IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay	Promega	G9242	Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader	BioTek		Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software	BioTek	GEN5