Neonatal Cardiac Scaffolds: Matrizes novas para Estudos Regenerativa

Resumo

Nestes estudos, que fornecem metodologia para novos, neonatal, andaimes cardíacas murinas para uso em estudos de regeneração.

Resumo

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States^1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.². Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart³. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact⁴. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,^5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

Introdução

A insuficiência cardíaca é comum e mortal. É uma doença progressiva que resulta na diminuição da contractilidade do coração, o que prejudica o fluxo sanguíneo para os órgãos e deixa as necessidades metabólicas do corpo não satisfeitas. Estima-se que 5,7 milhões de americanos têm insuficiência cardíaca e é a principal causa de hospitalização nos Estados Unidos ^9. O custo coletivo de tratamento de pacientes com insuficiência cardíaca nos Estados Unidos ultrapassa os US $ 300 bilhões de dólares por ano ^9-10. O único tratamento definitivo para a insuficiência cardíaca em fase terminal é o transplante cardíaco ortotópico. Cada ano, estima-se que mais de 100.000 corações transplantados são necessários para os procedimentos de transplante cardíaco nos Estados Unidos ^1-2. Devido ao número limitado de doadores, apenas cerca de 2.400 transplantes são realizados a cada ano em os EUA ^2. Claramente, esta escassez de órgãos precisa ser tratada como outras estratégias são necessários para produzir órgãos adicionais para transplantação e, idealmente, estes órgãos seriam autóloga, de modo a evitar as complicações associadas com a rejeição e imunossupressão vida.

Cardiomiócitos adultos mamíferos demonstrar uma capacidade de regeneração limitada após lesão, mas evidências recentes sugerem que os corações neonatais mamíferos manter uma notável capacidade de regeneração após lesão ^5-8. Especificamente, após a ressecção cirúrgica parcial, uma janela de regeneração foi descoberto entre o dia do nascimento e pós-natal 7. Este período de regeneração é caracterizada por uma falta de cicatriz fibrótica, formação de neo vascularização, libertação de factores angiogénicos a partir do epicárdio, e proliferação de cardiomiócitos ^{8/5 , 11.} Esta janela de tempo regenerativa fornece o potencial para a utilização do coração neonatal como uma nova fonte de material para o desenvolvimento de um coração bioartificial.

A matriz extracelular é conhecida por fornecer pistas importantes para promover cardiomyocyte a proliferação e crescimento. Diferenças distintas na disponibilidade de moléculas nas matrizes neonatais e adultos ^{de 12} e sua capacidade para promover a regeneração foram exploradas ^13. matrizes adultos descelularizados têm sido utilizados em vários estudos para fornecer um andaime ECM para repovoamento celular e a geração de um coração bioartificial. Embora esses estudos, e novas descobertas em tecnologias de células-tronco, estão avançando rapidamente, vários obstáculos ainda precisam ser cumpridos. Por exemplo, as limitações em preservando a estrutura nativa da matriz, a integração celular na parede da matriz, e capacidade para suportar a proliferação e crescimento de todos os limites do sucesso desta abordagem. Enquanto atributos regenerativos superiores têm sido atribuídas ao coração neonatal, os aspectos práticos da utilização de um tecido tal têm limitado a sua exploração.

Com base na capacidade regenerativa demonstrada do coração neonatal, desenvolvemos novas matrizes através do desenvolvimento de umtécnica de descelularização para o coração do rato P3. O coração P3 foi escolhido para estes estudos, uma vez que está dentro da janela de regeneração cardíaca como anteriormente determinada ⁶ mas o coração é suficientemente grande para colheita, decellularize e recellularize. O objetivo deste estudo é demonstrar a viabilidade da criação de uma matriz de um coração neonatal mouse. Os nossos estudos fornecem evidência para a viabilidade de um minuto descelularizante, coração neonatal, mantendo a integridade estrutural e proteinácea do ECM. Nós também demonstrar a capacidade de recellularize este ECM cardíaca com mCherry cardiomiócitos expressam e examinamos esses cardiomiócitos para a expressão de vários marcadores cardíacos seguintes recelularização. Esta tecnologia permitirá que para o ensaio da superioridade de uma matriz neonatal para o desenvolvimento de um coração bioartificial.

Protocolo

Todas as experiências de rato foram realizados de acordo com o Animal Welfare Act dos EUA e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Minnesota.

1. Método para coração mouse Isolamento

1. Euthanize um rato neonatal por decapitação com uma única lâmina de uso.
2. Pincelar o tórax com 70% de etanol.
3. Dissecar a pele do peito, cortando-o afastado da parede torácica com uma tesoura padrão enquanto puxa a pele lateralmente com um par de # 5 fórceps.
4. Perfurar o abdômen logo abaixo do esterno com a tesoura de corte através da parede abdominal. Agarrando o processo xifóide com # 5 fórceps, retrair o esterno rostral a partir do corpo durante o corte que as nervuras de ambos os lados da caixa com a tesoura. A caixa torácica é refletida superiormente com a pinça para revelar o coração.
5. Sem rodeios dissecar os dois principais lóbulos do timo puxando lateralmente com # 5 fórceps, expondoo arco da aorta, bem como as veias cavas e pulmonares.
6. Transecto as principais artérias do arco aórtico e da própria aorta, com a tesoura primavera 10 cm. Reter a aorta entre a base do coração e a artéria inominada. Segure as extremidades dos vasos rompidos com o # 5 fórceps para refletir o coração para a frente, separando-a da traquéia e esôfago.
7. Transecto a vasculatura pulmonar e outras veias principais, através do corte entre os pulmões e o coração em ambos os lados do coração com a tesoura de mola 10 cm. As veias permanecer aberta para fornecer drenagem.
8. Tiraram o coração do mediastino com o # 5 fórceps, segurando as extremidades cortadas dos grandes vasos. Colocar o coração num prato de cultura de 60 mm contendo solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) para a cateterização.

2. Método para Decelularização por Langendorff Perfusão

1. Prepare o conjunto de cateter com antecedência. Desenhar uma secção 4 centímetrosde PE 50 tubos em uma pequena chama de álcool para criar um cateter menores, mais finos. Aparar as extremidades com uma lâmina para satisfazer as dimensões (aprox. OD 300 mm de diâmetro exterior com uma flange de aprox. OD 500 mm) mostrado na Figura 1. Isto irá proporcionar dois cateteres simétricos de ambos os lados do puxar.
2. O ponto final do corte do tubo para dentro da chama brevemente, para derreter uma flange para a abertura na extremidade mais fina.
3. Encher a seringa de 12 ml com PBS e montar o cateter, colocando uma torneira de passagem de 3 vias em a seringa. Adicionar um 22 G x 1 agulha para a torneira e conduzir a agulha através do septo. Deslize o tubo do cateter PE arrastado para cima da agulha (fig. 1).
4. Lavar as peças montadas com PBS, assegurando que todas as bolhas de ar foram removidas.
5. Insira o cateter, preparado como descrito acima, para a aorta do coração isolado, não se estendendo para além da válvula aórtica e ligar com um empate de 7-0 sutura. Coloque o flange de tele cateter proximal contra o empate, fazendo um selo apertado e impedindo o coração de saindo do cateter.
6. Observe o cateterismo sob ampliação, enquanto suavemente perfusão do coração utilizando a seringa contendo PBS. Certifique-se de que não há vazamentos no sistema e o tecido homogeneamente empalidece como sangue latente é removido.
7. Colocar o septo para dentro do gargalo do adaptador para entrada e selá-lo, dobrando os lados sobre o vidro.
8. Anexar o reservatório cheio com 60 ml de sulfato de dodecilo de sódio a 1% (SDS) em água destilada _(dH2O) através de uma linha de comprimento suficiente para produzir uma coluna que gera 20 mmHg de pressão, como mostrado na Fig. 1. Calcula-se a pressão da altura da coluna de líquido com base na relação de 1 mm Hg é igual a 1,3595 centímetros H ₂ O.
   Cuidado: SDS é um pó altamente flocculent com propriedades irritantes. O contacto deve ser evitado. Lidar com o pó usando vestuário de protecção adequado.
9. Perfundir o coração com 1% SDS, durante 14 horas. O coração será translúcido na aparência sem tecido restante observável.
10. Lave o sistema até a torneira da solução SDS restante e substituí-lo com 10 ml dH ₂ O. Perfundir o coração com 10 ml de 1% de Triton X-100 (diluídos em água destilada), seguido de 10 ml de dH ₂ O, seguido por 60 ml de PBS contendo 1x penicilina estreptomicina (Pen-Strep).
11. Armazenar o coração em PBS 1x com Pen-Strep a 4 ° C. Se a aplicação de pós descelularização destina a perfusão requer, então, deve ser mantido o cateter na aorta, de outra forma reduzir o laço de sutura e o remover do cateter.

Determinação 3. DNA

1. Prepara-se uma digestão de ECM o coração ou o controlo descelularizado utilizando 200 ug / ml de proteinase K em KCl 50 mM, _MgCl2 2,5 mM, 0,45% de Tween 20 em 10 mM de Tris (pH 8,3).
2. Incubar o tecido a 55 ° C com agitação até que o tecido é dissolvido,tipicamente 4-5 h.
3. Quantificar o teor de ADN do homogeneizado com um ADN de ensaio de ligação de ^4,11.

4. Fixação e secção de tecido

1. Fix descelularizados, corações repovoados ou P3 controlo em paraformaldeído a 4% em PBS durante 30 min à temperatura ambiente.
2. Lavar o tecido 3x em PBS.
3. Colocar o tecido numa solução de 7,5% de sacarose em tampão de fosfato 0,1 M a 4 ° C até que se afunda.
4. Mudar a solução a 15% de sacarose em tampão de fosfato 0,1 M a 4 ° C, novamente, até que se afunda.
5. Aquecer o tecido a 37 ° C, substituir metade do volume com solução de gelatina em 15% de sacarose e tampão de fosfato 0,1 M e equilibrar durante a noite. Concentrações de gelatina são aumentadas por passos através de 1%, 2,5%, 5% e, finalmente, 7,5%, duas vezes.
6. Coloque as amostras em cryomolds usando fresco gelatina 7,5%. Para restaurar o formato das amostras descelularizados, gelatina líquido pode ser perfundida para dentro das câmaras como tele corações são moldados. Congelar, flutuando os cryomolds em nitrogênio líquido. Armazenar a -80 ° C.
7. Cut (10 mm de espessura) seções com um criostato. Trazer o slide perto da superfície da seção e observe a seção de se mover para fora da faca na superfície devido à carga nos slides eletrostaticamente tratados. Secam-se as lâminas durante a noite e armazenar a -80 ° C para análise futura.
8. Retirar as lâminas do congelador, equilibrar à temperatura ambiente e, em seguida, colocar num frasco Coplin contendo PBS durante 20 min a 37 ° C para dissolver a gelatina.
9. Manchar as seções de corte a partir do Passo 4.7 com Hematoxilina e Eosina. Colocar as lâminas em um frasco Coplin. Expor as lâminas hidratados no passo 4.8 a hematoxilina durante 45 segundos, a água da torneira durante 1,5 min, tampão durante 3 min, a água da torneira durante 1 min, agente anil durante 1,5 min, 80% de etanol durante 1 min, alcoólica eosina Y durante 8 segundos, etanol a 80% durante 1 minuto, 100% de etanol durante 1 min 2x, agente de compensação (substituto de xileno) 3x durante 1 min, a lamela com resinameio de montagem com base. Examine os slides microscopicamente.
10. Para confirmar a retenção de reactividade proteína da MEC do ECM coração, mancha para proteínas estruturais de ECM tais como colagénio IV, colocando os diapositivos hidratadas numa câmara humidif içada e trata-se com 10% de soro de burro normal (NDS) em salino tamponado com fosfato com 0,1% de Triton -X100 (PBST) durante 1 h à temperatura ambiente (TA). Utilizar um volume suficiente para cobrir as secções de tecido.
11. Substituir a solução com o anticorpo primário de escolha para uma diluição determinada empiricamente em 5% NDS / PBST. Por exemplo, o anticorpo do colagénio IV foi diluído a 1: 150. Incubar durante a noite a 4 ° C.
12. Lavam-se as lâminas com PBST 3x e aplicar um anticorpo secundário de escolha conjugado com um corante fluorescente. Dilui-se o anticorpo por uma quantidade determinada empiricamente. Incubar durante 1 h à TA. Lavar 3x com PBS.
13. Corar as lâminas com um corante de ligação a ADN, tais como DAPI para verificar a ausência de núcleos celulares usando uma mounti contendo DAPIng médio quando a tampa deslizando os slides.
14. Examinar as lâminas com um microscópio de fluorescência a 50 a 400x.

5. P1 Neonatal Murino Ventricular Cardiomyocytes para Recellularization

1. Spray de cada filhote com 70% de etanol e decapitar com uma única lâmina de uso.
2. Segure cada filhote entre o polegar eo indicador, enquanto o tórax é dividido na linha média com pequenas tesouras estéreis para expor a cavidade torácica. Aplicar pressão para permitir que o coração se projetam livremente do peito, enquanto ele é cortado livre dos grandes vasos e os átrios deixando apenas o tecido ventricular.
3. Colocar cada coração directamente para um tubo de 50 ml contendo 20 ml de cálcio arrefecido com gelo, solução salina tamponada de Hank livre de bicarbonato com 4- (2-hidroxietil) 20 mM -1-piperazinoetanossulfónico (CBFHH) até que todos os corações são recolhidos.
4. Aspirar o CBFHH e adicionar 10-15 ml de CBFHH fresca (gelada) para o tubo. Lavar o tecido por agitação do tecido em tele tubo várias vezes.
5. Decantar a solução contendo os corações em um 60 milímetros de plástico de Petri.
6. Dissecar qualquer tecido atrial latente dos corações sob ampliação no gelo aparando-lo longe dos corações com a tesoura primavera. Picar-se os ventrículos em pedaços pequenos tamanho homogéneo. Remover qualquer tecido não-ventricular separado do prato com # 5 fórceps.
7. Pipetar tanto da solução CBFHH como é necessário para transferir os fragmentos de tecido em um pequeno frasco esterilizado que contém uma barra de agitação micro estéril.
8. Permitir que o tecido para sedimentar para o fundo do frasco e remover a solução CBFHH.
9. Perfaz-se 50 ml de uma solução de enzima de 1,75 mg / ml de tripsina, 20 ug / ml de DNase II em CBFHH. Pipetar 5 ml desta solução de enzimas e adicioná-lo para um tubo contendo o tecido ventricular e picada lugar num agitador magnético. Agita-se a uma taxa constante (340 rpm) à temperatura ambiente durante 8 min.
   NOTA: A ação agitação deve ser suave e ainda permitirpara a suspensão da pasta.
10. Retirar o frasco da placa de agitação e permitir que a pasta fluida a sedimentar durante 3 min. Pipeta e descartar o sobrenadante inicial digerir, pois ele contém principalmente células do sangue e restos de tecido.
11. Pipetar uma segunda alíquota de 5 ml da solução de enzima e adicioná-lo ao ventrículo digestão. Agita-se durante 8 minutos e permitir que a sedimentar durante mais 3 min. Antes de iniciar as digestões, preparar dois tubos de 50 mL (rotulados 1 e 2), cada um contendo 12 ml de soro fetal de bovino gelada (FBS). Coloque um filtro de células 40 mm no topo de cada tubo. Pipet esse sobrenadante para o filtro no tubo 1.
12. Repetir o processo de digestão um adicional de 8 vezes, alternando-se a colocação do sobrenadante Digest entre os dois tubos contendo FBS. Dividir o último sobrenadante igualmente entre tubos 1 e 2 para garantir volumes iguais em cada tubo.
    NOTA: Cada tubo de recolha de agora irá conter 32,5 ml volume total de suspensão de células.
13. Centrifugar os tubos contêmção do sobrenadante a 150 xg durante 6 minutos a 4 ° C.
14. Durante a recolha das alíquotas de digestão, preparar cinco placas de cultura de tecidos de 100 mm com 6 ml de meio (de Eagle Modificado por Dulbecco meios (DMEM) com 10% FBS, 1x Pen-Strep, 1x L-glutamina) por placa. Incubar estas alíquotas a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 30 minutos para equilibrar os meios de comunicação.
15. Aspirar a mistura de enzimas CBFHH e ressuspender as células em 30 ml de meio de cultura preparado acima, combinando as células de ambos os tubos de recolha.
16. Retorno de 6 ml de suspensão celular a cada uma das placas de 100 mm e incubar durante 45 min a 37 ° C.
17. No final da incubação, transferir as células não aderentes a 5 novos pratos e re-incubar durante 45 minutos (a fracção de fibroblastos terá começado a aderir aos pratos e podem ser cultivadas separadamente, se desejado).
18. No final da segunda rodada de pré-chapeamento, recolher os meios de comunicação e as células não aderentes de pratos e girar os meios de comunicação em 150xg durante 6 min.
19. Colhem-se o excesso de meios para levar as células à concentração desejada aproximada, (4,0 x 10 ⁵ células por construto em 100 ul de perfusato). Retirar uma alíquota para contagem e ou a viabilidade de testes ^14.

6. biorreator Recellularization de P3 coração Matrix

1. Pretreat a matriz de coração isolado com meios de cultura (ver Passo 5,15) durante a noite antes de adicionar as células.
2. Montar os elementos de um sistema de Langendorff, como mostrado na Fig. 2. Autoclave as peças de vidro e óxido de etileno esterilizar as peças de plástico para garantir a esterilidade. Vários sub-unidades do sistema pode ser montado numa câmara de fluxo laminar antes de ser montado no cavalete de suporte. Circulating banho de água e trajecto de escoamento de água aquecida foi omitida para maior clareza.
3. Encha o sistema montado com 120 ml de meio de cultura de tecidos (ver passo 5.15).
4. Colocar a matriz de coração cateterizada do Passo 2,14 em um cul 60 milímetrostura Prato sob ampliação e ligar uma seringa de 1 mL com 22 L x 1 agulha carregada com suspensão de células a partir do Passo 5,20 para o cateter. Certifique-se de que esta montagem é livre de bolhas de ar para evitar embolizante o coração.
5. Suavemente perfundir os 100 ul de suspensão de células no interior da matriz do coração através das artérias coronárias. Depois de concluído, retire a combinação seringa / agulha.
   NOTA: A perfusão lenta de aprox. 20? L por min é necessária para impedir que as células se escoe para fora das veias, que transitam pelo coração.
6. Com um topo romba 22g fixada ao encaixe de Luer sobre o lado de baixo da tampa frasco de biorreactor coração, empurrar o cateter para o topo.
7. Iniciar a bomba peristáltica e observa-se que o fluxo procede conforme descrito na Figura 2. Rendimentos fluir a partir do reservatório através da bomba através do borbulhador para o cateter colocado na aorta no Passo 2.5 (vermelho caminho na Fig. 2). Observar o fluxo da circulação cardíaca fora da veias e gotejamento a partir do vértice, para recirculação do reservatório meios.
   NOTA: A taxa de fluxo de perfusão é dependente de factores individuais, tais como a resistência vascular da construção, e o tamanho do coração, mas uma taxa de 50 a 100 ul / min é um bom ponto de partida. Em pontos de tempo intermédios, avaliação funcional pode ser executado. A escala de tamanho do coração repovoados neonatal limita as avaliações, o que pode ser realizado, mas nós determinamos que os sistemas baseados opticamente pode ser utilizado para quantificar a bater comportamento do mesmo modo que foram usadas em corações de ratos adultos. ⁴ A construção pode ser perfundido para estendida períodos de tempo (até 23 h).

Resultados

decelularização
Em média, o tempo para a descelularização de um coração P3 utilizando este protocolo é de aproximadamente 14 horas. dado um peso médio do coração de 23 mg para o recém-nascido P3.

acelularidade
Figura 3a mostra um coração neonatal P3 totalmente intacto (conjunto de montagem). Figura 3b mostra o mesmo coração seguinte descelulariza?...

Discussão

A dependência desta técnica em perfusões repetidas do coração faz a prevenção de uma embolia um componente crítico de um bom resultado. A partir do cateterismo do coração inicial nos Passos 2,2-2,6, para as mudanças de solução entre as etapas 2.8-2.14, existem manipulações que podem permitir a introdução de bolhas de ar que comprometem o fluxo de perfusato no miocárdio. Devido ao tamanho diminuto do coração neonatal, mesmo minúsculas bolhas na vasculatura pode causar um enfarte técnica, tornando as...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Materials For Mouse Heart Isolation
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)	Jackson Laboratories	21577	or equivalent
60 mm Culture dish	BD Falcon	353004	or equivalent
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile)	Hyclone	SH30256.01	or equivalent
Single Use Blade	Stanley	28-510	or equivalent
Standard Scissors	Moria Bonn (Fine Science Tools)	14381-43	or equivalent
Spring Scissors 10 cm	Fine Science Tools	15024-10	or equivalent
Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-00	or equivalent
#5 Forceps	Dumnot (Fine Science Tools)	11295-00	or equivalent
2. Materials For Decellularization
Inlet adaptor	Chemglass	CG-1013	autoclavable
Septum	Chemglass	CG-3022-99	autoclavable
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing	Cole-Parmer	EW-06422-10	autoclavable
Male luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K33	autoclavable
Female luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K26	autoclavable
Prolene 7-0 surgical suture	Ethicon	8648G	or equivalent
Ring stand	Fisher Scientific	S47807	or equivalent
Clamp	Fisher Scientific	05-769-6Q	or equivalent
Clamp regular holder	Fisher Scientific	05-754Q	or equivalent
60 cc syringe barrel	Coviden	1186000777T	or equivalent
Beaker	Kimble	14000250	or equivalent
22g x 1 Syringe Needle	BD	305155	or equivalent
12 cc syringe	Coviden	8881512878	or equivalent
3-way stop cock	Smith Medical	MX5311L	or equivalent
22 x 1 g needle	BD	305155	or equivalent
PE50 tubing	BD Clay Adams Intramedic	427411	Must be formable by heat. Polyethylene recommended
1% SDS	Invitrogen	15525-017	Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.
1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use.
Sterile dH2O	Hyclone	SH30538.02	Or MilliQ system purified water.
1X Pen/Strep	Corning CellGro	30-001-Cl	or equivalent
3. Materials For DNA Quantitation
Proteinase K	Fisher	BP1700	>30U/mg activity
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	or equivalent
MgCl*6H2O	Mallinckrodt	5958-04	or equivalent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	or equivalent
Tris base/hydrochloride	Sigma-Aldrich	T1503/T5941	or equivalent
Pico-Green dsDNA assay kit	Life Technologies	P7589	requires fluorimeter to read
4. Method for fixation and sectioning of tissue.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	or equivalent
Gelatin Type A from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	must be 300 bloom or greater
5. Method for tissue histology
Cryomolds 10 x 10 x 5mm	Tissue-Tek	4565	or equivalent
Cryostat	Hacker/Bright	Model OTF	or equivalent
Microscope Slides  25 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-19	or equivalent
Hematoxylin 560	Surgipath/Leica Selectech	3801570	or equivalent
Ethanol	Decon Laboratories	2701	or equivalent
Define	Surgipath/Leica Selectech	3803590	or equivalent
Blue buffer	Surgipath/Leica Selectech	3802915	or equivalent
Alcoholic Eosin Y 515	Surgipath/Leica Selectech	3801615	or equivalent
Formula 83 Xylene substitute	CBG Biotech	CH0104B	or equivalent
Permount Mounting Medium	Fisher Chemical	SP15-500	or equivalent
Collagen IV Antibody	Rockland	600-401-106.1	or equivalent
α-Actinin Antibody	Abcam	AB9465	or equivalent
mCherry Antibody	Abcam	AB205402	or equivalent
NKX2.5 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-8697	or equivalent
Donkey anti-mouse AF488 Antibody	Life Technology	A21202	or equivalent
Donkey anti-chicken AF594 Antibody	Jackson Immunoresearch	703-585-155	or equivalent
Donkey anti-goat CY5 Antibody	Jackson Immunoresearch	705-175-147	or equivalent
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594	Jackson Immunoresearch	111-587-003	or equivalent
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36930	or equivalent
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating.
HBSS (Ca, Mg Free)	Hyclone	SH30031.02	or equivalent
HEPES (1M)	Corning CellGro	25-060-Cl	or equivalent
Cell Strainer	BD Falcon	352340	or equivalent
50 mL tube	BD Falcon	352070	or equivalent
Primeria 100 mm plates	Corning	353803	Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity
Trypsin	Difco	215240	or equivalent
DNase II	Sigma-Aldrich	D8764	or equivalent
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)	Hyclone	SH30022.01	or equivalent
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V6629	or equivalent
Fibronectin coated plates	BD Bioscience	354501	or equivalent
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30910.03	or equivalent
Heart bioreactor glassware	Radnoti Glass Technology	120101BEZ	Must be sterilizable by autoclaving or gas.