Evaluación de biomarcadores en Glioma por Immunohistochemistry en parafina-encajado 3D Glioma desarrolló culturas

Resumen

Neuroesferas crecidos como culturas 3D constituyen una poderosa herramienta para estudiar la biología del glioma. Aquí presentamos un protocolo para realizar inmunohistoquímica manteniendo la estructura 3D de glioma neuroesferas a través de la inclusión en parafina. Este método permite la caracterización de propiedades de desarrolló de glioma como troncalidad y diferenciación de los nervios.

Resumen

Análisis de expresión de proteínas en glioma es relevante por varios aspectos en el estudio de su patología. Se han descrito numerosas proteínas como biomarcadores con aplicaciones en diagnosis, pronóstico, clasificación, estado de progresión del tumor y estado de diferenciación celular. Estos análisis de biomarcadores también son útiles para caracterizar el tumor neuroesferas (NS) generados a partir de pacientes de glioma y modelos de glioma. Tumor NS proporcionan un modelo valioso en vitro para evaluar diversas características de tumor de que se derivan y pueden más exactamente espejo glioma biología. Aquí describimos un método detallado para analizar biomarcadores en tumor NS mediante inmunohistoquímica (IHQ) en tumor de parafina-encajado NS.

Introducción

Los gliomas son los tumores sólidos primarios del sistema nervioso central clasificados por sus características fenotípicas y genotípicas según la Organización Mundial de la salud¹. Esta clasificación incorpora la presencia o ausencia de mutaciones del conductor, que representan una atractiva fuente de biomarcadores². Biomarcadores son características biológicas que pueden ser medidas y evaluadas para indicar procesos normales y patológicos, así como la respuesta farmacológica a una intervención terapéutica³. Biomarcadores se pueden detectar en el tejido del tumor y las células derivadas de glioma, lo que permite su caracterización biológica en diferentes aspectos. Algunos ejemplos de biomarcadores de glioma mutado Isocitrato deshidrogenasa 1 (IDH1), una enzima del mutante de gliomas de bajo grado asociados a mejor pronóstico⁴. IDH1 transformada se expresa con frecuencia en combinación con el síndrome de la alfa-talasemia/retraso mental X-ligado (ATRX) y TP53-hacer inactivo mutaciones, definiendo un glioma específico subtipo^4,5. ATRX inactivar mutaciones también se producen en el 44% de gliomas de alto grado pediátrica^2,6 y han sido asociadas con tumores agresivos e inestabilidad genómica^6,7. Además, los gliomas del pontine intrínsecos difusos pediátricos (DIPG) se distinguen en subgrupos según la presencia o ausencia de una mutación de K27M en el gene de histona H3 H3F3A, o en el gen HIST1H3B/C^1,6. Por lo tanto, la introducción de caracterización molecular permite la subdivisión, estudio y tratamiento de los gliomas como entidades separadas, que se permite el desarrollo de más objetivo terapias para cada subtipo. Además, puede utilizarse el análisis de biomarcadores para evaluar diferentes procesos biológicos tales como apoptosis⁸autofagia⁹, de la progresión del ciclo celular¹⁰, proliferación de la célula¹¹y diferenciación celular¹² .

Modelos animales modificados genéticamente que albergan las lesiones genéticas presentes en los cánceres humanos son críticos para el estudio de la señalización de las vías que median la progresión de la enfermedad. Nuestro laboratorio ha implementado el uso del sistema transposasa belleza durmiente (SB) para el desarrollo de modelos de ratón modificados genéticamente de glioma abrigar mutaciones específicas que recapitulan glioma humano subtipos^13,14. Estos modelos de ratón modificados genéticamente se utilizan para generar tumor derivado NS, que permiten estudios en vitro en un sistema 3D, espejadas características presentan en los tumores in situ¹⁵. Además, el trasplante de orthotopical de NS en ratones puede generar tumores secundarios que retienen características del tumor primario y mímico las características histopatológicas, genómicas y fenotípicas del tumor primario correspondiente¹⁵.

En cultivo libre de suero, las células del tumor cerebral con propiedades de células madre pueden ser enriquecidas y en presencia de factores de crecimiento epidérmicos (EGF) y factores de crecimiento de fibroblasto (FGF), pueden cultivarse como solo colonias derivadas de células como las culturas NS. En este sistema de cultivo selectivo, mayoría diferenciadoras o diferenciadas de las células mueren rápidamente, mientras que células madre se dividen y forman los grupos celulares. Esto permite la generación de una cultura de NS que mantiene glioma tumor características^16,17,18. Glioma NS puede utilizarse para evaluar varios aspectos de la biología del tumor, incluyendo el análisis de biomarcadores que tienen aplicaciones en diagnosis, pronóstico, clasificación, estado de progresión del tumor y estado de diferenciación celular. Aquí detallamos un protocolo generar glioma NS e integrar las culturas 3D en parafina para ser utilizado para la tinción de IHC. Una ventaja de fijación y embebido glioma NS es que la morfología del NS se mantiene mejor en comparación con el cytospin convencional método¹⁹, en que glioma NS son sometido a manipulación estresante para disociación celular y ser aplanado. Además, incrustar apaga cualquier expresión endógena fluoróforo de tumor genéticamente NS, lo que permite la tinción a través de los espectros fluorescentes. El objetivo general de este método es preservar la estructura 3D de las células del glioma a través de un proceso de inclusión de parafina y caracterización de neuroesferas de glioma usando immunohistochemistry.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Michigan.

1. generación de neuroesferas de Tumor cerebral derivado de un modelo de ratón

1. Antes del procedimiento de la disección, preparar medios de células madre neurales (NSC medios: DMEM/F12 con 1 x B27 suplemento, suplemento de x N2 1, normocin x 1 y 1 x antibiótico/antimicótico con recombinante humano EGF y basic-FGF a concentraciones de 20 ng/mL de cada una). Llene un tubo de 1,5 mL con 300 μL de medio de NSC y reservamos para más adelante.
2. Seleccione un ratón con un tumor grande.
   Nota: El tamaño de un tumor puede ser monitoreado por bioluminiscencia si el plásmido o el virus inyectado codifica luciferin. Generalmente, un tumor grande tiene una bioluminiscencia de > 10⁶ fotones/s/cm²/sr.
3. Eutanasia el ratón con una sobredosis de isoflurane: infundir un papel con isoflurano e introducir el tejido en una cámara euthanization, evitando el contacto directo con los ratones para evitar irritación. Espere hasta que los ratones no muestran un reflejo pedal (generalmente 5-10 min). Decapitar el ratón y diseccionar el cerebro como se describe en Calinescu et al. ¹³.
4. Si los tumores son fluorescentes, usar un microscopio de disección equipado con una lámpara fluorescente para identificar la masa del tumor dentro del cerebro. Con pinzas finas, disecar el tumor (generalmente 5-7 mm de diámetro) del tejido normal del cerebro.
5. Coloque el tumor disecado en el tubo de 1,5 mL con medios de NSC (paso 1.1). Homogeneizar el tumor con un mortero plástico desechable que se adapta a las paredes del tubo de microcentrífuga aplicando una presión suave.
6. Para disociar los grumos de células, añadir 1 mL de medio de disociación enzima libre e incubar por 5 min a 37 ° C.
7. Filtrar la suspensión de células a través de un tamiz de célula μm 70 y lavar el filtro con 20 mL de medio de NSC.
8. Centrifugar a 300 x g durante 5 min, decantar el sobrenadante y resuspender el pellet en 6 mL o 15 mL de medio de NSC, dependiendo del tamaño de la pelotilla.
9. Placa de la suspensión de células de tumor en un matraz de cultivo T-25 o T-75 y el cultivo a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos con una atmósfera de 95% aire y 5% CO₂.
10. Después de 3 días, transferir el NS suspendido sano y les placa vuelva a introducirlos en un matraz de cultivo de tejidos T-25 o T-75. Si es necesario, agregue más medios de NSC a la cultura.
    Nota: Normalmente habrá una población mixta de células, algunos estarán muertos, algunos habrán adherido y algunos formando NS que va flotando en los medios de comunicación

2. mantenimiento y pases el NS

Nota: Evitar el crecimiento excesivo y mantener las células en la relativamente alta densidad. Confluencia se determina por el tamaño de las esferas (centros negro de sobrecrecimiento medias esferas grandes). La tasa de crecimiento de la NS dependerá de los oncogenes para generar tumores.

1. Una vez que la cultura NS llega a confluencia, recoger la cultura en un tubo de centrífuga estéril y el NS a 300 x g durante 5 min de la pelotilla.
2. Descartar el sobrenadante, agregar 1 mL de la solución de separación celular y pipeta para Resuspender el pellet.
3. Incubar a 37 ° C por 5 min, agitando el tubo cada 2 min para ayudar a la disociación celular.
   Nota: Cuando NS llega a confluencia, puede normalmente verse macroscópicamente como pequeñas esferas blancas. Para asegurar la disociación celular, por lo menos todos lo NS visible debe haber desaparecido.
4. Añadir 5 mL de HBSS 1 x y pipeta varias veces. Células de pellets a 300 x g por 5 min descartar el sobrenadante. Resuspenda el sedimento en 5 mL de medio de NSC complementado con recombinante EGF y FGF básico.
5. Añadir 1 mL de células a 15 mL de NSC medios y cultura en un matraz T-75 a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos con una atmósfera de 95% aire y 5% CO₂.
6. Añadir factores de crecimiento (EGF y FGF básico) cada 3 días. Si los medios de comunicación se convierte en luz naranja y las células aún no están confluentes, cambiar los medios de comunicación. Para ello, centrifugar el NS a 300 x g durante 4 min y resuspender en medios NSC suplementados con factores de crecimiento.
   Nota: Dependiendo del tamaño del precipitado formado, las células deba dividirse en frascos más.

3. NS de congelación para el almacenamiento a largo plazo

1. Cuando la cultura NS llega a ser confluente, disociar las células como se describe en los pasos 2.1-2.4. Una vez que el sedimento ha sido suspende de nuevo en HBSS, quite una alícuota y contar las células.
2. Centrifugar las células a 300 x g durante 4 min y quitar tanto como sea posible del sobrenadante.
3. Resuspenda el sedimento en medios (SFB inactivado con calor, 10% DMSO) de congelación. Se recomienda congelar entre 1 x 10⁶ y 3 x 10⁶ células por vial por mL.
4. Se dividen las células suspendidas de nuevo en crioviales tantas como sea necesario y poco a poco enfriar los frascos por primera transferencia a hielo, luego a-20 ° C, entonces a-80 ° C y finalmente al día siguiente a un contenedor de almacenamiento de nitrógeno líquido.

4. fijación de Tumor NS

1. Tumor de cultura NS en un matraz T-25 durante 2-3 días hasta que las células son confluentes (~ 3 x 10⁶ células). Recoger tumor NS en un tubo cónico de 15 mL de un frasco confluente T-25 uno menos. De pellets a 300 x g durante 5 minutos.
2. Vuelva a suspender el sedimento en 1 mL de formol al 10% y mantener a temperatura ambiente (RT) por 10 minutos añadir 5 mL de 1 x HBSS y sedimenten las células como en el paso 3.2. Repita este paso una vez más.
3. Coloque el tubo cónico de 15 mL que contiene el precipitado en el hielo.

5. parafina fijación de Tumor NS

1. Resuspenda el sedimento lavado de NS en 500 μl de agarosa líquida caliente 2% y mezclar suavemente por pipeteo.
2. Coloque inmediatamente el NS agarosa incrustada en hielo hasta que la agarosa se polimeriza. Retire la pieza de agarosa que el NS. Coloque la pieza de agarosa polimerizada con el NS en el cartucho para el tejido procesado (figura 2).
3. Continuar con el proceso de tejido (con un procesador de parafina automático) y parafina inclusión (mediante una estación de inclusión).

6. secciones de parafina-encajado NS

1. Ajuste el baño de agua a 42 ° C y coloque la aspa en el micrótomo cuidadosamente con dos pinceles para asegurarse de que está nivelado. Utilice esta hoja para recortar.
2. Coloque el bloque de parafina en el micrótomo. Con la mano no dominante, presione hacia abajo la palanca situada en el lado izquierdo que controla el espesor de cada sección. Pulse para la segunda parada que indica un espesor de 30 μm.
3. Empiece a recortar el bloque (es decir., quitar exceso parafina) girando la rueda de mano gruesas con la mano derecha hasta llega a la superficie de la muestra. En este punto, suelte la palanca que controla el espesor de corte 10 μm o 5 μm. Dejar de cortar cuando se llega a la superficie de la muestra.
4. Llenar una nevera con hielo y agregar suficiente agua para que cuando el bloque de parafina se coloca en el hielo, el agua actúa como una película alrededor del bloque de parafina, protege de tocar directamente el hielo. Incubar en hielo por 20 min el bloque de parafina.
5. Deseche la hoja vieja e inserte uno nuevo para seccionamiento. Bloque seco con una gasa, colocarla en el micrótomo.
6. Con la mano no dominante, obtener un par de fórceps curvos que se utiliza para tirar de la cinta de parafina. Mantener un pincel húmedo cerca de la mano derecha, que se utilizará para la transferencia de la cinta de la parafina a baño María. Empezar sección girando la rueda de mano gruesas con la mano derecha a un rápido ritmo. Use las pinzas en la mano izquierda para sostener la cinta de parafina.
7. Utilice el pincel húmedo para transferir la cinta de la parafina a baño María.
8. Utilice la curva de las pinzas para romper aparte las secciones superficialmente colocando la pinza entre dos secciones de la parafina y luego empujando suavemente las dos secciones a.
   Nota: Este movimiento debe ser totalmente en la superficie de la sección de la parafina. No presione hacia abajo en la sección.
9. Utilice el pincel húmedo para empujar las secciones de parafina separados sobre portaobjetos de adhesión cargado positivamente.
10. Deje que los portaobjetos se seque durante la noche dentro de una campana química antes de almacenarlas en cajas de portaobjetos. El almacenamiento de portaobjetos depende del tipo de mancha que se realiza.

7. inmunohistoquímica (IHQ) de parafina-encajado NS

1. Derretir la parafina por colocar los portaobjetos en un estante del metal e incubar a 60 ° C por 20 min.
2. Desparafinizar el portaobjetos por la incubación en un tren de rehidratación en RT: 3 x xileno durante 5 min, etanol de 2 x 100% por 2 min, etanol al 95% 2 x 2 min, etanol al 70% 1 x durante 2 minutos y 1 x agua desionizada durante 2 minutos Hereon, guardar las diapositivas de agua del grifo hasta recuperación de antígeno , como secar causará Unión de anticuerpos no específicos.
3. Incubar los portaobjetos en tampón de citrato (ácido cítrico de 10 mM, 0.05% de detergente no iónico, pH 6) a 125 ° C por 30 s y a 90 ° C durante 10 s. Dejarlos enfriar, luego enjuague los portaobjetos 5 veces con agua destilada.
4. Incube los portaobjetos en RT en 0.3% H₂O₂ durante 30 minutos.
5. Lave los portaobjetos 3 veces en buffer (0.025% detergente en TBS) por 5 min con suave agitación de lavado.
6. Incubar los portaobjetos en RT con bloqueo de solución (suero de caballo 10%, 0.1% de BSA en TBS) durante 30 minutos.
7. Incube los portaobjetos durante la noche a 4 ° C en una cámara humidificada con anticuerpo primario preparado en la solución de dilución (0.1% de BSA en TBS). Lave los portaobjetos 3 veces en buffer por 5 min con suave agitación de lavado.
8. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 1 h con anticuerpo secundario biotinilado preparado en solución de dilución. Lave los portaobjetos 3 veces en buffer por 5 min con suave agitación de lavado.
9. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente en oscuridad durante 30 minutos con la avidina biotinilado peroxidasa complejo. Lave los portaobjetos 3 veces en buffer por 5 min con suave agitación de lavado.
10. Incube los portaobjetos con DAB-H₂O₂ substrato marcas aquí durante 2-5 min a TA.
11. Enjuagar 3 veces con agua del grifo. Inmersión (1-2 s) las diapositivas de hematoxilina en solución de contratinción y enjuagarlos bien en agua del grifo hasta el claro.
12. Deshidratar el portaobjetos como sigue: incubar en agua destilada durante 2 minutos, 3 veces la inmersión en etanol al 80%, incubar en etanol al 95% 2 veces por 2 minutos, incubar en etanol al 100% 2 veces por 2 minutos cada uno y finalmente en xileno 3 veces por 3 minutos cada uno.
13. Cubreobjetos portaobjetos con un medio de montaje con xileno y deje secar sobre una superficie plana, a temperatura ambiente hasta que estén listas para la proyección de imagen.       Nota: En caso de 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) de tinción, las diapositivas pueden almacenarse a TA. Sin embargo, si se realiza tinción de inmunofluorescencia, diapositivas deben almacenarse en la oscuridad a-20 ° C para reducir el blanqueo de foto.

Resultados

Para monitorear el desarrollo de tumores y evaluar si el tumor ha alcanzado el tamaño necesario para generar NS, analizamos la luminiscencia emitida por tumores mediante bioluminiscencia. Esto permite el estudio de la eficiencia de la transducción de señales en los cachorros y la progresión del tumor por la señal de luminiscencia de luciferasa (figura 1A y 1B). Cuando el tamaño de tumor alcanza una señal de 1 x 10^...

Discusión

En este artículo detallamos un método reproducible y versátil para realizar inmunohistoquímica en parafina-encajado glioma NS, que mantienen la característica estructura 3D de las células del tumor en el cerebro in situ. Esta técnica posee las siguientes ventajas sobre usar células plateadas en superficies de plástico o vidrio: i) preservación de la estructura 3D del NS; II) evitando de la tensión de disociación celular antes del análisis de expresión de la proteína; III) amortiguamiento de cualqu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated microtome blade HP35	Thermo Scientific	3150734
Microtome RM 2135	Leica	MR2135
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-aldrich	HT501128-4L
Rabbit polyclonal anti-ATRX,	Santa Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2	Millipore	AB9610	IHC, 1:500 dilution
Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated	Dako	E0432	IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit	Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT	Biocare medical	BDB2004 L/price till 12/18
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
N-27 Supplement	ThermoFisher	A3582801
Accutase® Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
AGAROSE LE	GoldBio	A-201-1000
Genesee Sc. Corporation	Olympus 15 ml	21-103
Genesee Sc. Corporation	TC-75 treated Flask	25-209
Genesee Sc. Corporation	TC-25 treated Flask	25-207
DMEM/F12	Gibco	11330-057	NS media
HBSS	GibcoTM	14175-103	balanced salt solution
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse