En Vivo inhibición de MicroRNA para disminuir el crecimiento tumoral en ratones

Resumen

Este protocolo describe los modelos de xenoinjerto y ratón ortotópico de la tumorigenesis tiroidea humana como una plataforma para probar los tratamientos inhibidores basados en microARN. Este enfoque es ideal para estudiar la función de los ARN no codificantes y su potencial como nuevas dianas terapéuticas.

Resumen

Los MicroRNAs (miRNAs) son reguladores importantes de la expresión génica a través de su capacidad para desestabilizar el ARNm e inhibir la traducción de arNM objetivo. Un número cada vez mayor de estudios han identificado los miRNAs como biomarcadores potenciales para el diagnóstico y pronóstico del cáncer, y también como dianas terapéuticas, añadiendo una dimensión adicional a la evaluación y el tratamiento del cáncer. En el contexto del cáncer de tiroides, la tumorigenesis se debe no sólo a mutaciones en genes importantes, sino también a la sobreexpresión de muchos miRNAs. En consecuencia, el papel de los miRNA en el control de la expresión del gen tiroideo está evolucionando como un mecanismo importante en el cáncer. En este documento, presentamos un protocolo para examinar los efectos de la administración de inhibidores de miRNA como una modalidad terapéutica en el cáncer de tiroides utilizando xenoinjerto tumoral humano y modelos de ratón ortotópico. Después de diseñar células tumorales tiroideas estables que expresan GFP y luciferasa, las células se inyectan en ratones desnudos para desarrollar tumores, que pueden ser seguidos por bioluminiscencia. La inhibición in vivo de un miRNA puede reducir el crecimiento tumoral y regular las metas del gen del miRNA. Este método se puede utilizar para evaluar la importancia de un miRNA in vivo determinado, además de identificar nuevas dianas terapéuticas.

Introducción

El cáncer de tiroides es una neoplasia maligna endocrina con una incidencia creciente, aunque en términos generales tiene un buen resultado¹. Sin embargo, algunos pacientes desarrollan formas agresivas de la enfermedad que son intratables y las bases moleculares no se entienden mal².

Los miRNAs son ARN no codificantes de 22 nucleótidos que regulan la expresión génica en muchos tejidos, normalmente por unión de pares de bases a la región no traslacional de 3' (3'UTR) de ARN mensajeros objetivo (RNRa), desencadenando la degradación del ARNm o la represión traslacional ^{3 , 4}. Cada vez hay más pruebas que demuestran que la desregulación de la expresión de microARN es un sello distintivo del cáncer, ya que estas moléculas modulan la señalización proliferativa, la migración, la invasión y la metástasis, y pueden proporcionar resistencia a la apoptosis ^5,6. En los últimos años, muchos estudios han identificado los miRNAs como biomarcadorespotenciales para el diagnóstico y pronóstico del cáncer, así como las dianas terapéuticas 7, proporcionando una nueva dimensión a la evaluación y el tratamiento del cáncer.

los miRNAs han tomado el centro del escenario en oncología molecular humana como factores clave de las neoplasias tiroideas humanas^8,9,10,11,12. Entre los miRNAs regulados, miR-146b está altamente sobreexpresado en tumores de carcinoma tiroideo papilar (PTC) y se demostró que aumenta significativamente la proliferación celular, y se asocia con agresividad y pronóstico sombrío^{6, 12 , 13 , 14 , 15}. Además, miR-146b regula varios genes tiroideos implicados en la diferenciación^12,y también importantes genes supresores de tumores como PTEN¹⁶ y DICER1¹⁷. A pesar de su importancia en la biología del cáncer, la terapia oncológica basada en miRNA todavía está en sus primeras etapas, y muy pocos estudios han abordado el cáncer de tiroides - el más frecuente de los tumores endocrinos¹⁸. Aquí describimos un protocolo utilizando dos modelos de ratón diferentes con tumores derivados del ser humano, en el que la administración de un inhibidor de miRNA sintético (antagomiR) que inhibe específicamente un miRNA celular puede bloquear el crecimiento tumoral. Primero utilizamos un modelo de xenoinjerto común, y la administración intratumoral local de un crecimiento tumoral disminuido de antagomiR medido como una reducción en la bioluminiscencia tumoral¹⁶. Debido a que el establecimiento de modelos de ratón robustos que imitan la progresión tumoral humana es esencial para desarrollar enfoques terapéuticos únicos, la implantación ortotópica de tumores humanos primarios es una plataforma más valiosa para la validación clínica de nuevos fármacos que modelos de implantación subcutánea. Así, con el fin de evaluar mejor el potencial terapéutico del antagomiR, utilizamos un modelo de ratón ortotópico con parto sistémico en el torrente sanguíneo, obteniendo los mismos resultados.

Protocolo

La experimentación con animales se llevó a cabo en cumplimiento de la Ley de la Comunidad Europea (86/609/CEE) y la ley española (R.D. 1201/2005), con la aprobación del Comité de ética del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC, España).

1. Inoculación de flanco de células y tratamiento de antagomiR intratumoral

1. Preparación celular
   1. Diseñar una línea celular de cáncer de tiroides humana Cal62 (mutaciones KRAS^G12R y p53^A161D) para sobreexpresar una construcción transgénica que expresa constitutivamente GFP y luciferasa (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP). Seleccione las células transgénicas por resistencia a antibióticos o clasificando las células gFP positivas con citometría de flujo.
   2. Cultivar las células en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con penicilina, estreptomicina y 10% suerobovino fetal (FBS) a 37 oC y 5% CO 2.
   3. Suspenda 1 x 10⁶ células en 50 salinas tamponadas de fosfato (PBS) a 4 oC.
2. Inoculación celular en los flancos de los ratones
   1. Mezclar las células con la misma cantidad de matriz de membrana del sótano. Por ejemplo, agregue 1 x 10⁶ células en 50 l de PBS a 50 l de matriz de membrana de sótano (ver Tabla de materiales)y mezcle suavemente.
      Nota:
   2. Inyectar 100 l de la muestra (células en PBS + matriz de membrana de sótano) por vía subcutánea en el flanco izquierdo de los ratones INMUNOdeficientes de 6 semanas de EDAD de BALB/c nu/nu utilizando una jeringa de insulina de 1 ml con una aguja 27G 1/2'' (0,4x13 mm).
3. Tratamiento de antagomiR intratumoral.
   1. Suspenda el antagomiR (ver Tabla de Materiales)o el control negativo en 500 l de agua destilada libre de RNase.
   2. Antes de la inyección, prepare 2 nmol del antagomiR o el control junto con un reactivo de administración in vivo (ver Tabla de Materiales)para cada inyección.
      1. Primero mezcle la solución de antagomiR (ver Tabla de Materiales)y el búfer de complejidad (ver Tabla de Materiales)en una proporción 1:1. Por ejemplo, añada 80 ml de solución inhibidora de miRNA (16 nmol) a 80 l de tampón de complejidad (incluido en el kit de reactivos de entrega in vivo, véase Tabla de materiales).
      2. Lleve el reactivo de entrega in vivo a temperatura ambiente. Añadir 160 l a un tubo de 1,5 ml e inmediatamente añadir 160 ml de solución de antagomiR diluida. Devolver el reactivo restante a -20 oC. Si es necesario, guarde el reactivo a 4oC hasta una semana después de la descongelación.
      3. Vórtice inmediatamente (10 s) para asegurar la complejidad del reactivo-antagomiR de la entrega in vivo.
      4. Incubar la mezcla reactivo-antagomiR de entrega in vivo durante 30 min a 50oC. Centrifugar brevemente el tubo para recuperar la muestra.
      5. Diluir el complejo 6 veces añadiendo 1360 sl de pH DE PBS 7.4 y mezclar bien.
      6. Proceda con la entrega in vivo del complejo reactivo-antagomiR (8 ratones/condición), o almacene el complejo a 4 oC hasta una semana antes de la inyección. Inyectar 200 ml intratumoralmente en cada tumor (2 nmol de antagomiR).
         NOTA: El volumen y la cantidad del antagomiR son independientes del volumen del tumor.
   3. Realizar el tratamiento 3 veces por semana (lunes, miércoles y viernes) durante 2 semanas.
4. Análisis del crecimiento tumoral
   1. Inyectar por vía subcutánea 50 ml de una solución de 40 mg/ml de sustrato de D-luciferina (ver Tabla de materiales)por vía subcutánea en cada punto de tiempo con una jeringa de 1 ml con una aguja de 27G 1/2'' (0,4 mm x 13 mm).
      1. A 8 minutos después de la inyección, anestesiar a los ratones usando 3% de isoflurano mezclado con oxígeno. Evaluar el nivel de anestesia por reflejo de pedal (pellizco de dedo del pies firme) y ajustar el parto anestésico según corresponda para mantener el plano quirúrgico.
      2. Aplique pomada oftálmica en ambos ojos para prevenir la desecación.
   2. Imagen de la señal bioluminiscente con el software de imágenes in vivo (ver Tabla de Materiales).
      NOTA: Los calibradores también se pueden utilizar para medir el volumen del tumor y el crecimiento del tumor.
   3. Una vez obtenidas las señales de bioluminiscencia, analice el crecimiento tumoral comparando ambos tratamientos y determine la importancia mediante una prueba t. Para analizar la varianza dentro del grupo, utilice el SEM.
5. Escisión tumoral
   1. Siete días después del final del tratamiento de antagomiR, sacrificar a los ratones, extirpar el tumor y extraer proteínas y/o ARN para análisis futuros. Alternativamente, seccione los tumores y arréglalos para la inmunohistoquímica.

2. Inoculación ortotópica tiroidea de células y tratamiento de antagomiR sistémico

1. Preparación celular
   1. Diseñar una línea celular de cáncer de tiroides humana Cal62 para sobreexpresar una construcción transgénica que expresa constitutivamente GFP y luciferasa. Seleccione las células transgénicas por resistencia a antibióticos o clasificando las células gFP positivas con citometría de flujo.
   2. Cultivar estas células en DMEM suplementadas con antibióticos (penicilina y estreptomicina) y 10%FBS a 37oC y 5% CO 2.
   3. Suspenda 1 x 10⁵ células en 5 sL de PBS.
2. Inoculación celular en la glándula tiroides de ratones
   1. Inyectar 100 ml de analgésico (buprenorfina) y 100 l de antibiótico (cefalosporina) por vía subcutánea en ratones BALB/c nu/nu de 7 semanas de edad. Desinfectar el lugar de inyección con alcohol.
   2. Inyectar 5 ml de la solución celular en la glándula tiroides de los ratones.
      1. Anestetizar el ratón usando 3% de isoflurano mezclado con oxígeno y colocarlo bajo un estereomicroscopio en un gabinete de flujo estéril.  Evaluar el nivel de anestesia por reflejo de pedal (pellizco de dedo del pies firme) y ajustar el parto anestésico según corresponda para mantener el plano quirúrgico.
      2. Aplique pomada oftálmica en ambos ojos para prevenir la desecación.
      3. Para cada ratón, desinfectar el cuello con yodopovidona y hacer una incisión de aproximadamente 2 cm en la piel con tijeras. Una vez abierto, exponer el cuello desplazando las glándulas salivales.
      4. Disecciona los músculos de la correa usando fórceps de disección y/o tijeras para exponer la tráquea y la glándula tiroides. Usando una jeringa de microlitro de 10 l inyectar 5 l de la solución celular en el lóbulo tiroideo derecho, situado en el lado del cartílago cricoide.
      5. Vuelva a colocar las glándulas salivales y suturar la incisión con seda utilizando suturas trenzadas, recubiertas y no absorbibles.
      6. Agregue iodopovidona a la zona de la herida y coloque el ratón sobre una manta térmica mientras se recupera de la anestesia.
   3. Al día siguiente después de la cirugía, inyectar por vía subcutánea analgésico (buprenorfina) y añadir 3 ml de ibuprofeno líquido (40 mg/ml) en 250 ml de agua potable durante 1 semana.
3. AntagomiR sistémico tratamiento
   NOTA: Realice este paso 2-3 semanas después de la inyección celular, cuando la señal bioluminiscente sea detectable.
   1. Suspenda el antagomiR o el control negativo en agua destilada libre de RNase.
   2. Antes de la inyección, prepare 7 nmol del antagomiR o el control junto con el reactivo de administración in vivo para cada inyección.
      1. Para el antagomiR y la preparación de la solución de reactivo de administración in vivo, consulte el paso 1.3, pero agregue 7 nmol del inhibidor de miRNA por ratón.
   3. Administrar la solución por vía intravenosa mediante inyección retro-orbital del seno venoso del ratón. Use isoflurano para inducir anestesia.
      NOTA: Evaluar el nivel de anestesia por reflejo de pedal (pellizco de dedo del dedo del pecho firme).
   4. Tratar a los ratones 3 veces a la semana (lunes, miércoles y viernes) durante 2 semanas.
4. Análisis del crecimiento tumoral
   1. Determinar la señal bioluminiscente del tumor dos veces por semana para calcular el crecimiento del tumor.
      1. Inyectar 50 ml de una solución de 40 mg/ml de sustrato de D-luciferina en cada punto de tiempo mediante inyección subcutánea.
      2. A 8 minutos después de la inyección, anestesia a los ratones usando 3% de isoflurano mezclado con oxígeno e imagen de la señal bioluminiscente con el software de imagen in vivo.
   2. Una vez obtenidas las señales de bioluminiscencia, analice el crecimiento tumoral comparando ambos tratamientos y determine la importancia mediante una prueba t. Para analizar la varianza dentro del grupo, utilice el SEM.
5. Escisión tumoral
   1. Siete días después del final del período de tratamiento de antagomiR, sacrificar los ratones, extirpar el tumor y extraer proteínas y/o ARN para análisis futuros. Alternativamente, seccione los tumores y arréglalos para la inmunohistoquímica.

Resultados

Usamos dos modelos de ratones diferentes para determinar si la neutralización de un miRNA podría suprimir el crecimiento tumoral. En consecuencia, las células de tiroides de tumores humanos Cal62-luc se inyectaron por vía subcutánea en los flancos de ratones desnudos para generar un modelo de xenógrafo. Después de dos semanas, se establecieron tumores que se podían medir con pinzas. En ese momento, los ratones se inyectaron por vía intratumoral con el inhibidor del miR-146b, o un control adecuado, y se siguió e...

Discusión

Este artículo describe un método para estudiar la función in vivo de un miRNA con el fin de entender mejor su papel en la iniciación y progresión del tumor, y su potencial como diana terapéutica en el cáncer de tiroides. Los modelos de xenoinjerto tumoral aquí descritos se basan en el uso de células que pueden ser rastreadas por su señal de bioluminiscencia, permitiendo la medición del crecimiento tumoral in vivo bajo la influencia de un tratamiento. Además, describimos el uso de un tratamiento basado en miRN...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor	Thermo Fisher	4464088	In Vivo Ready
Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration	Corning	#354248
DICER antibody	Abcam	ab14601	IHQ: 1/100
In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent	Thermo Fisher	IVF3005
In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System	Caliper Life Sciences
Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1	Thermo Fisher	4464077	In Vivo Ready
PCNA antibody	Abcam	ab92552	WB: 1/2,000
PTEN antibody	Santa Cruz	sc-7974	WB: 1/1,000
XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate	PerkinElmer	122799	Diluted in PBS