Ex Vivo Ткань Культура Модель хряща Ремоделирования в Bovine колено Explants

Здесь мы представляем протокол, описывающий изоляцию и культивирование эксрастений хряща от бычьих коленей. Этот метод обеспечивает простой и доступный инструмент для описания изменений тканей в ответ на биологические стимулы или новые терапевтические средства, направленные на сустав.

Аннотация

Системы культуры Ex vivo охватывают широкий спектр экспериментов, посвященных изучению тканей и клеточной функции в родной обстановке. Хрящ является уникальной тканью, важной для правильной функции синовиального сустава и состоит из плотной внеклеточной матрицы (ECM), богатой протеогликаном и коллагеном II типа. Хондроциты являются единственным типом клеток, присутствующих в хрящевой и широко распространены и относительно низкив по количеству. Измененные внешние стимулы и клеточная сигнализация могут привести к изменениям в составе ЭКМ и ухудшению, которые являются важными патологическими признаками при таких заболеваниях, как остеоартрит (ОА) и ревматоидный артрит.

Модели хряща Ex vivo позволяют 1) профилирование хондроцитов опосредованного изменения оборота хрящевой ткани, 2) визуализации состава хряща ECM, и 3) хондроцитов перестановки непосредственно в ткани. Профилирование этих изменений в ответ на стимулы или лечения имеют большое значение в различных аспектах биологии хряща, и дополняют эксперименты in vitro в изолированных хондроцитах, или более сложные модели у живых животных, где экспериментальные условия труднее контролировать.

Хрящ explants представить переводный и легко доступный метод для оценки ткани ремоделирования в хрящеe ECM в контролируемых условиях. Здесь мы описываем протокол для изоляции и культивирования живых выемок хряща крупного рогатого скота. Метод использует ткани из бычьего колена, который легко доступен из местной бойни. Оба explants и обусловленной среды культуры можно проанализировать для того чтобы исследовать оборачиваемость ткани, состав ECM, и функцию хондроцита, таким образом профилировать модуляцию ECM.

Введение

Хондроциты производят и поддерживают матрицу хряща. Для того, чтобы изучить биологию хондроцитов и как они и окружающие ECM реагируют на внешние раздражители, очень важно, чтобы допросить их в их родной среде¹^,². Изучение текучести хрящевой ткани важно для расширения понимания основных механизмов в суставных заболеваний, таких как ОА, болезнь, для которой в настоящее время нет болезни изменения лечения. Следовательно, существует значительная потребность в улучшении моделей перевода².

Ex vivo характеристика клеточных и тканей эффекты имеет важное значение для дополнения других доклинических моделей, как в пробирке, таких как хондроцит монослой культур, и in vivo, таких как хирургия индуцированных моделей ОА или аутоиммунных коллагена индуцированной модели артрита (ЦРУ ). Многочисленные исследования выявили различия между тем, как клетки ведут себя в 2D монослойных культур и 3D структур или в их родной ткани³^,⁴. Многие клетки в 2D слоях принимают неестественные морфологии, в том числе различия в полярности клеток и привязанности тканей, в результате чего как визуальные, так и функциональные различия в клетках в родных тканях⁵. Различия также проявляются в функциональности клеток, которые могут сдвинуть экспрессию белка, что приводит к глубоко измененным дифференциации моделей, регулятивного механизма и функциональности клеток⁵^,⁶^,⁷ ^,⁸.

Хрящ ECM состоит в основном из коллагена типа II, обеспечивающего матричную основу, и аггрекан, протеогликан, который помогает удерживать жидкость в ткани. Другие молекулы матрицы, такие как коллаген типа IV, VI, IX, X, XI, XII, фибронектин, хрящ олигомерный белок (COMP), biglycan, декорин, и perlecan также присутствуют⁹.

Хотя этиология ОА остается неясным¹⁰^,¹¹, начало заболевания, как полагают, вызвано дисбалансом в текучести тканей и процессов ремонта¹²^,¹³. Деградация суставного хряща является отличительной чертой ОА. Хондроциты или клетки в окружающих тканях увеличивают высвобождение цитокинов, стимулируя повышенную выработку протеиназов, таких как матричные металлопротеиназы (ММп) и аггреканатазы, которые усиливают деградацию хряща ECM ¹⁴. Эта деградация приводит к освобождению небольших уникальных фрагментов белка, называемых неоэпитопами, которые могут быть количественно в сыворотке, моче или культуре среды¹⁵. При формировании и созревании коллагена также высвобождаются так называемые профрагменты; они могут быть количественно как мера производства матрицы¹⁶.

Целью данного протокола является создание модели хряща ex vivo для сравнения влияния стимуляции и/или медикаментозного лечения на оборот тканей ECM. Оборот хряща профилируется путем измерения матричных биоэпитопных биомаркеров непосредственно в условной среде культуры с использованием ELISA: AGNx1 (отражающая активность аггреканазы), C2M (отражающая активность матрицы MMP) и ProC2 (отражающий коллаген II типа формирования). Выводы могут быть проверены гистологическим окрашиванием ECM, который также визуализирует организацию хондроцитов в отдельных эксцатах. Описанный протокол может быть использован для проверки влияния новых методов лечения на функцию хондроцитов и оборот хряща ECM. Ряд исследований использовали хрящевые экспланты для описания биологических процессов или влияния вмешательства на цитокин-оспоренные экспланты с использованием количественных гистологических или иммуногистохимических подходов, мРНК, экспрессии белка или протеомики² ^,¹⁷^,¹⁸. Однако эти протоколы выходят за рамки текущей рукописи.

протокол

1. Изоляция тканей

Ткань источников
1. Выполните весь раздел поиска ткани за ламинарным капотом потока в асептической среде.
2. С местной скотобойни, получить весь свежий бычьего тибиофеморального коленного сустава от телят в возрасте от 1,5 до 2 лет.
3. Аккуратно вскрыть икроное колено, сначала удалив избыток плоти, вскрывая кондилы, мениска, сухожилий и синовиальной мембраны. Вырезать сухожилия и синовиальной мембраны, что позволяет сустава расчленить. Удалите мениск, чтобы разоблачить бедренные кондилы.
4. Изолировать эксматериалы из несущей области бедренной кондилов с помощью 3 мм биопсии перфоратор и освободить их от суставной поверхности путем резки скальпелем параллельно и как можно ближе к подхондрятель кости, как это возможно. Твердая структура подхноловой кости должна гарантировать, что экспланты не содержат кальцинированную матрицу. Стремитесь к эксламтам с равномерной высотой.
5. Немедленно храните и смешивайте экспланты в DMEM/F12- GlutaMAX - 1% P/S культуры среды в 50 мл трубки или Петри блюдо. Не смешивайте экспланты с разных колен коров, но держите отдельно для каждого исследования.
Ткань культивирования
1. Перенесите экспланты на стерильную 96-ну хорошую пластину в ламинарном капоте.
2. Вымойте explants 3 раза в среде культуры или PBS и культуры их в 200 зЛ культуры среды в хорошо до начала эксперимента. Используйте период вымывания 1 день для синхронизации биопсии клеточной активности и пассивного высвобождения биомаркеров.
3. Культура explants до 10 недель в инкубаторе 37 градусов с 5% CO₂. Поместите все репликации в каждой группе по диагонали в культурной пластине, чтобы свести к минимуму изменения, вызванные испарением. Чтобы избежать испарения супернатанта, добавьте PBS к внешним колодцам культурной плиты.

2. Лечение эксплантатором хряща крупного рогатого скота и оценка метаболической активности

Культура среднего изменения и лечения
1. Изменение среды культуры каждые 2-3 дня в ламинарной капоте потока.
2. При применении каких-либо процедур, подготовить их до изменения среды. Подготовьте обработки к познавательной концентрации в скважинах explant разбавлять в среде культуры.
3. Аккуратно удалите супернатант из каждой скважины и перенесите его на новую пластину 96 скважин. Храните супернатант с уплотнительной лентой при 20 градусах Цельсия для анализа биомаркеров текучести тканей и экспрессии белка.
4. Немедленно добавьте 200 л свежей среды культуры или лечения в скважине. Не позволяйте эксцатам высохнуть во время среднего изменения и убедитесь, что все экспланты полностью погружены в новую среду.
Резазурин окрашивания
1. Измеряйте метаболическую активность один раз в неделю как косвенное измерение жизнеспособности клеток. Тест резазурина является простым способом оценки, если метаболическая активность эксплантов ухудшается для отдельных explant из-за клеточной смерти или клеточных изменений. Высаживания только в среде культуры имеют относительно стабильное чтение resazurin на протяжении всего периода эксперимента.
2. Сделать решение культуры среды с 10% resazurin.
3. Урожай супернатанта, как описано в шаге 2.1.3.
4. Погрузите экспланты в 10% растворина в течение 3 ч при 37 градусах по Цельсию или до тех пор, пока супернационты не повернут фиолетовыми. Включите 4 скважины без эксплансов в качестве фонового элемента управления.
5. Перенесите условный и фоновой контроль растворина в черную пластину микротитера и измерьте флуоресценцию при 540 нм.
6. Тщательно вымойте 3 раза в среде культуры или PBS и погрузить explants в среде мытья в течение 5-10 минут, чтобы resazurin полностью рассеять. Добавить новую среду культуры или лечения при использовании.

3. Прекращение, фиксация и хранение образцов

Прекращение периода культивирования
1. Измерьте метаболическую активность, описанную в шаге 2.2. Добавьте 200 л PBS в скважину.
Фиксация и хранение
1. Удалить PBS, добавить 200 л формальдегида в скважину, и оставить на 2 ч при комнатной температуре.
2. Утилизировать формальдегид и добавить 200 Л ПБС на скважину. Накройте тарелку уплотнительной лентой и храните при 4 градусах Цельсия для гистохимического анализа. Мы рекомендуем проводить гистохимический анализ в течение 3 месяцев.

4. Биомаркеры оборота тканей (ELISA)

Косвенные конкурентные ELISAs
1. Пальто стрептавидина пластины с конкретными биоинтинилатами асссеид ный пептид разбавленный 1:100 в буфере ассеа (100 л на хорошо) в течение 30 мин при 20 градусах Цельсия.
2. Вымойте 5 раз со стандартным буфером стирки и добавить образец-супернатант (20 л на скважину) вместе с первичным моноклональным антителом против ассеа целевого пептида, разбавленного 1:93.3 для ProC2 и 1:100 в буфере ассоса для AGNx1 (100 л на скважину) и инкубировать в течение 2 ч при 20 градусах Цельсия с встряхиванием для ProC2 и 3 ч при 20 кв. м для AGNx1.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Объем образца непосредственно взят из хранящихся супернатантных пластин. Если измеренная концентрация находится вне диапазона измерения, разбавьте супернатант в v-bottomed разбавленной пластине в PBS или буфере проверки.
3. Вымойте 5 раз со стандартным буфером стирки и инкубировать с пероксидаза помечены вторичные антитела разбавленной 1:100 в ассе-буфер (100 л на хорошо) в течение 1 ч при 20 градусов по Цельсию.
4. Вымойте 5 раз со стандартным буфером стирки и инкубировать с встряхиванием в течение 15 минут в темноте при 20 градусах Цельсия с тетраметилбензидином (TMB) в качестве субстрата пероксидазы (100 л на скважину).
5. Завершите реакцию стандартным стоп-шотом, 0,1 М Н₂SO₄ (100 л на скважину).
6. Прочитайте колористетриюреакцию при абсорбции 450 нм, используя эталонную абсорбцию на уровне 650 нм на стандартном лабораторном считывателе.
Прямые конкурентные ELISA для измерения оборота хрящевой ткани в супернатанте
ПРИМЕЧАНИЕ: Это количествли C2M.
1. Пальто стрептавидина пластины с конкретными биоинтинилатами асссеитария целевого пептида разбавленной 1:100 в буфере ассе (100 л на хорошо) в течение 30 мин при 20 градусах Цельсия.
2. Вымойте 5 раз с мытьем буфера и добавить образец-супернатант вместе с 100 злител емким имонотальным антителом с маркировкой пероксидазы против разбавленного целевого пептида 1:100 в буфере анализов (20 л на колодец). Инкубировать в течение 20 ч при 2-8 градусов с встряхиванием.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Объем образца непосредственно взят из хранящихся супернатантных пластин. Если измеренная концентрация находится вне диапазона измерения, разбавьте супернатант в v-bottomed разбавленной пластине в PBS или буфере проверки.
3. Вымойте 5 раз со стандартным буфером стирки и инкубировать с встряхиванием в течение 15 минут в темноте при 20 градусах Цельсия с TMB в качестве субстрата пероксидазы (100 qL на скважину).
4. Завершите реакцию стандартным стоп-шотом, 0,1 М Н₂SO₄ (100 л на скважину).
5. Прочитайте колористетриюреакцию при абсорбции 450 нм с эталонным абсорбцией на 650 нм на стандартном лабораторном считывателе.
AGNx1
1. Количественно еггрекан деградации путем измерения выпуска AGNx1 нео-эпитопа. Этот косвенный конкурентный ассси сeaл цели аггрекан C-терминал пептид (NITEGE³⁷³) порожденных ADAMTS-4 и 5 декольте. Моноклональное антитело распознает все фрагменты с помощью обнажённых эпитопа NITEGE. Экспериментальные детали ассея были опубликованы в другом месте¹⁹.
ProC2
1. Количественное образование коллагена II типа путем измерения выпуска профрагмента коллагена II типа. Этот косвенный конкурентный обзор ELISA нацелен на эпитоп пропептида PIIBNP (DVR-PG), генерируемого N-пропептидазами во время обрезки недавно синтезированного коллагена II типа. Экспериментальные детали ассея были опубликованы в другом месте¹⁶.
C2M
1. Количественная деградация коллагена типа II путем измерения выделения фрагмента неоэпитопа C2M. Этот прямой конкурентный ELISA признает MMP-расщепляется C-терминал пептид (KPPGRDGAAG¹⁰⁵³). Этот ассеиотличается от AGNx1 и ProC2, так как это первичное антитело, которое маркируется пероксидаза и, таким образом, используется в качестве детектора. Экспериментальные детали ассея были опубликованы в другом месте²⁰.

5. Гистологический анализ

Инфильтрация, встраивание и резка
1. Поместите фиксированные экспланты (см. шаг 3.2) в индивидуально маркированные кассеты. Включите как этикетку в кассету, так и кассеты с этикеткой для обеспечения идентификации.
2. Перенесите кассеты, содержащие экспланты, в машину для процессора тканей. Затем проникают в экстенсы с парафином в серии обезвоживания и парафиновой инфильтрации шагов.
  1. Обезвоживание с 96% этанола в течение 90 минут без корректировки температуры. Повторите этот шаг 3 раза.
  2. Очистить этанол с толуолом в течение 90 минут без корректировки температуры. Повторите этот шаг 2 раза.
  3. Очистить этанол с толуолом в течение 90 мин при 60 градусах По Цельсию.
  4. Проникать с парафиновым воском в течение 30 мин при 60 градусах Цельсия.
  5. Проникать с парафиновым воском в течение 60 мин при 60 градусах Цельсия.
  6. Проникать с парафиновым воском в течение 90 мин при 60 градусах Цельсия.
  7. Для каждого шага добавьте растворы в образец камеры с медленным выкачиванием и насосными потоками под 33-34 кПа. Запустите процесс инфильтрации в цикле давления/вакуума с максимальным вакуумом от 65 до 70 кПа.
3. После инфильтрации поместите кассеты на нагревательный блок, чтобы обеспечить тщательное удаление вылазов из кассеты. Аккуратно встраивайтесь в проинфильтртированные экспланты в отдельные парафиновые блоки. С нагретыми щипчинками, место explants с поверхностным суставным хряща и подхналовых костных сторон перпендикулярно резки поверхности, обеспечивая визуализацию различных слоев хряща в каждом разделе образца.
4. Вырезать 5 мкм разделы охлажденных парафин-блоков со встроенными эксплантированными на микротоме. Перенесите вырезанные секции на холодную ванну. При необходимости разделы можно отделить либо скальпелем, либо крышкой стекла.
5. Используя непокрытую стеклянную горку тщательно, перенесите секции на теплую водяную ванну (50 градусов по Цельсию), где разворачиваются секции. Поднимите каждую секцию на маркированную крышку слайда и поместите на горячую тарелку в течение 30 минут.
6. Поместите слайды в корзину и инкубировать при 60 градусах по Цельсию в течение 1 ч, а затем держать их на ночь при 37 градусах Цельсия. В дальнейшем храните слайды в закрытых контейнерах при 4 градусах Цельсия до окрашивания.
Safranin O/Fast Green окрашивание и визуализация
1. Поместите горки, чтобы быть окрашены в корзину и инкубировать слайды на 60 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
2. Приготовьте и процедите все реагенты фильтром 0,45 мм.
3. При подготовке к окрашиванию, залить фильтрованные реагенты в клювах на объем, который позволяет решениям полностью покрыть слайды при погружении в корзину. Для покрытия горок использовались клювы, которые требовали объемом 250 мл.
4. Депараффинизировать расплавленные горки, погрузив корзину в толуол в течение 10 минут дважды, 99% этанола в течение 2 минут дважды, 96% этанола в течение 2 минут дважды, и 70% этанола в течение 2 минут дважды. Затем увлажнить горки в воде в течение 2 мин.
5. Пятно депарафинизированных и гидратированных слайдов путем погружения корзины в растворе hematoxylin в Weigert (pH 1.5) в течение 10 минут, окунуться в 1% HCl один раз, и промыть проточной водопроводной водой в течение примерно 5 мин или до тех пор, пока избыток цвета смыло.
6. Далее, пятно в 0,05% Быстрый зеленый раствор (pH: 5,75) на 5 мин, окунуться в 1% CH₃COOH один раз, и пятно в 0,1% Safranin O (pH: 6,5) в течение 20 мин.
7. Обезвоживание и очистить слайды, окунув дважды в 70% этанола, 96% этанола в течение 2 минут дважды, 99% этанола в течение 2 минут в два раза, и толуол 2 мин в два раза.
8. Смонтировать непокрытые стеклянные горки с помощью синой среды, покрывающей гистологические горки.

Результаты

Бовин полноглубинные экспланты были изолированы, культурны, и лечение в течение 3 недель(рисунок 1). Культура среда была изменена с добавлением лечения 3 раза в неделю. Однажды еженедельно метаболическая активность измерялась с помощью резазурина. Биомаркеры оборота ECM и...

Обсуждение

Представленный здесь протокол для профилирования оборота хрящевой ткани в вылазках хряща крупного рогатого скота может быть использован для характеристики лечебных эффектов многих видов препаратов, включая ингибиторы воспалительных внутриклеточных путей, ингибиторы протеолитичес...

Раскрытие информации

CST, ACBJ и MK являются сотрудниками Nordic Bioscience. ACBJ и MK владеет акциями Nordic Bioscience. Остальным авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят технического персонала Nordic Bioscience за лабораторную поддержку, а также Датский исследовательский фонд за общую поддержку наших исследований.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
45% Iron(III) chloride solution	Sigma-Aldrich	12322
Acetic acid	Merck	1.00056.2500
Alamar Blue	Life tech Invitrogen	DAL1100
Biopsy processing cassettes – green	IHCWORLD	BC-0109G
Biopsy punch W/Plunger (3 mm)	Scandidat	MTP-33-32
Bovine cartilage (Bovine knees)	Local slaughterhouse
C2M	Nordic Bioscience		Fee for service
Corning 96-well plate	Sigma-Aldrich	CLS7007
Cover Glass Ø 13 mm	VWR	631-0150P
DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES	Gibco	31331-028
Ethanol ≥96%	VWR	83804.36
Ethanol absolute ≥99.5%	VWR	83813.36
exAGNx1	Nordic Bioscience		Fee for service
exPRO-C2	Nordic Bioscience		Fee for service
Fast green	Sigma-Aldrich	F7252
Formaldehyde solution 4%	Merck	1004965000
GM6001	Sigma-Aldrich	M5939-5MG
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3136
Hydrochloric acid	Merck	30721-M
IGF-1	Sigma-Aldrich	I3769-50UG
Oncostatin M	Sigma-Aldrich	O9635-10UG
Penicillin-streptomycin (P/S)	Sigma-Aldrich	P4333
Pertex (mounting medium for light microscopy)	HistoLab	811
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Safranin O	Sigma-Aldrich	S2255
Sterile Standard Scalpels	Integra Miltex	12-460-451
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	30743
SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides	Thermo scientific	J1800AMNT
TNF-alpha	R&D Systems	210-TA-100
Toluene	Merck	1.08327.2500
Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax	TPP	99955