Sıçanlarda Çevresel Özofagus Rekonstrüksiyonu için Doku-Mühendislik Greft

Özet

Özofagus rekonstrüksiyonu zorlu bir işlemdir ve özofagus mukozası ve kasının yenilenmesini sağlayan ve yapay greft olarak implante edilebilen doku mühendisliğiöz bir özofagusun geliştirilmesi gereklidir. Burada, iskele imalatı, biyoreaktör ekimi ve çeşitli cerrahi teknikler de dahil olmak üzere yapay bir özofagus oluşturmak için protokolümüzü saklı yız.

Özet

Çevresel özofagus rekonstrüksiyonu için biyouyumlu malzemelerin kullanılması sıçanlarda teknik olarak zorlu bir görevdir ve beslenme desteği ile optimal bir implant tekniği gerektirir. Son zamanlarda, özofagus doku mühendisliği birçok girişimleri olmuştur, ancak peristalsis özel ortamda erken epitelizasyon zorluk nedeniyle başarı oranı sınırlı olmuştur. Burada, iki katmanlı tübüler iskele, mezenkimal kök hücre tabanlı biyoreaktör sistemi ve modifiye edilmiş baypas besleme tekniği ile özofagus mukozası ve kas tabakalarının yenilenmesini iyileştirebilen yapay bir özofagus geliştirdik. gastrostomi. İskele poliüretan yapılır (PU) üç boyutlu (3D) baskılı polikaprolakon iplikçik dış duvara sarılmış silindirik bir şekil nanofibers. Transplantasyondan önce, insan kaynaklı mezenkimal kök hücreler iskelenin lümenine tohumlanmış ve hücresel reaktiviteyi artırmak için biyoreaktör ekimi yapılmıştır. Cerrahi anastomoz uygulayarak ve implante edilen protezi tiroid bezi flebi ile kaplayarak greft sağkalım oranını artırdık ve ardından geçici oral olmayan gastrostomi beslenmesi yaptık. Bu greftler histolojik analizde gösterildiği gibi implante edilen bölgelerin çevresinde ilk epitelizasyon ve kas rejenerasyonu bulgularını tekrar ortaya çıkarabildiler. Buna ek olarak, greft çevresinde artmış elastin lifleri ve nevasaskülarizasyon gözlendi. Bu nedenle, bu model çevresel özofagus rekonstrüksiyonu için potansiyel yeni bir teknik sunar.

Giriş

Konjenital malformasyonlar ve özofagus karsinomları gibi özofagus bozukluklarının tedavisi özofagusun yapısal segment kaybına yol açabilir. Çoğu durumda, gastrik pull-up kanalları veya kolon interpozisyonları gibi otolog replasman greftleri^1,2yapılmıştır. Ancak bu özofagus replasmanlarının çeşitli cerrahi komplikasyonları ve reoperasyon riskleri^{vardır 3}. Böylece, doku mühendislik özofagus iskeleleri yerli özofagus taklit kullanımı sonuçta kayıp dokuların yenilenmesi için umut verici bir alternatif strateji olabilir^4,5,6.

Doku ile tasarlanmış bir özofagus, özofagus defektlerinin mevcut tedavilerine potansiyel olarak bir alternatif sunsa da, in vivo uygulaması için önemli engeller vardır. Postoperatif anastomoz kaçağı ve implante özofagus iskelesi nekroz kaçınılmaz mediasten 7 gibi çevreleyen aseptik alan, ölümcül bir enfeksiyona yol . Bu nedenle yara ve nazogastrik tüpte gıda veya tükürük kontaminasyonunu önlemek son derece önemlidir. Primer yara iyileşmesi tamamlanana kadar gastrostomi veya intravenöz beslenme düşünülmelidir. Büyük hayvanlar iskele⁸implantasyonundan sonra 2-4 hafta boyunca sadece intravenöz hiperalimentasyon ile beslenebilir, çünkü bugüne kadar, özofagus doku mühendisliği büyük hayvan modellerinde yapılmıştır . Ancak küçük hayvanlarda özofagus nakli sonrası erken sağkalım için böyle bir oral olmayan beslenme modeli oluşturulmamıştır. Bunun nedeni hayvanların son derece aktif ve kontrol edilemeyen olmalarıdır, bu yüzden beslenme tüpünü uzun süre midelerinde tutamamışlardır. Bu nedenle küçük hayvanlarda az sayıda özofagus nakli vakası olmuştur.

Özofagus doku mühendisliği koşulları göz önüne alındığında, elektrospun nanofibers (iç tabaka; Şekil 1A) ve 3B baskılı iplikçik (dış tabaka; Şekil 1B) modifiye gastrostomi tekniği ni de içeren. Dahili nanofiber PU yapılır, bir un-gradable polimer, ve gıda ve tükürük sızıntısı nı önler. Dış 3D baskılı iplikçikler biyobozunur polikaprolakondan yapılmıştır (PCL), mekanik esneklik sağlayabilir ve peristaltik harekete uyum. İnsan yağtüretilmiş mezenkimal kök hücreler (hAD-MSCs) yeniden epitelizasyonu teşvik etmek için iskelenin iç tabakasında tohumlandı. Nanofiber yapısı hücre göçü için yapısal bir hücre dışı matriks (ECM) ortamı sağlayarak ilk mukozal rejenerasyonu kolaylaştırabilir.

Ayrıca biyoreaktör ekimi yoluyla aşılanmış hücrelerin sağkalım oranını ve biyoaktivitesini artırdık. İmplante edilen iskele, özofagus mukozası ve kas tabakasının daha istikrarlı bir şekilde yenilenmesini sağlamak için tiroid bezi flebi ile kaplandı. Bu raporda, iskele imalatı, mezenkimal kök hücre bazlı biyoreaktör ekimi, modifiye gastrostomi ile baypas besleme tekniği ve modifiye cerrahi dahil olmak üzere özofagus doku mühendisliği teknikleri için protokoller açıklanmaktadır. bir sıçan modelinde çevresel özofagus rekonstrüksiyonu için anastomoz tekniği.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler, Seul Ulusal Üniversitesi Hastanesi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC No. 17-0164-S1A0) tarafından onaylanmıştır.

1. İskele İmalatı

NOT: İki katmanlı özofagus iskeleleri elektrospinning ve 3D baskı birleştirilerek üretilmektedir. Boru iskelesinin iç zarı elektrospinning poliüretan (PU) ile üretilen ve dönen paslanmaz çelik mandreller ile^9.

1. Tübüler PU nanofiberlerin hazırlanması için, oda sıcaklığında 8 saat boyunca N,N-dimethylformamide (DMF) karıştırılarak PU polimerin %20 (w/v) çözeltisini hazırlayın.
2. Pu çözeltisini künt metal iğne (22 G) ile şırınganın üzerine yerleştirin ve dönen paslanmaz çelik mandrellere (çap = 2 mm) iğne ucu ile dönen kolektör arasında 30 cm mesafede elektrospin yerleştirin.
   NOT: Güç kaynağı 15 kV potansiyelyüksek voltajlı doğru akıma ayarlanır. Çözeltinin besleme hızı şırınga pompası kullanılarak 0,5 mL/h olarak sabitlenir.
3. Mandrel'in yüzeyinde 3,14 m/s'de dönen boruhalinde bir nanofiber tabaka yapın.
4. Artık çözücünün tamamen temizlenmesi için PU nanofiber'i bir gecede 40 °C'de bir vakum fırınında kurutun.
   NOT: Özofagus iskelesinin 3Boyutlu baskılı dış duvarı hızlı bir prototipleme sistemi kullanılarak hazırlanır. 3D baskı ekipmanı bir dağıtıcı, meme, sıkıştırma/ısı denetleyicisi, 3 eksenli dönüştürme aşaması ve yazılım sisteminden oluşur.
5. PCL peletler 100 °C'de ısıtma silindirinde çözülür ve biyoplotting sisteminin kontrolü altında yüksek basınçta (7 bar) nanofiberlerin yüzeyine basılır. Nozul boyutu 300 μm ve iplikçik mesafesi 700 μm'dir.
6. Mandrel iki katmanlı iskele çıkardıktan sonra, ultraviyole ışık altında% 70 etanol ıslatarak sterilize.
   NOT: Daha önceki çalışmalarda iskelenin daha ayrıntılı özellikleri bildirilmiştir¹⁰.

2. Greftlerde Hücre Tohumlama ve Biyoreaktör Yetiştiriciliği

NOT: Bir şirketten satın alınan insan yağtürtül mezenkimal kök hücreleri (hMSCs) değişiklik yapılmadan kullanılmıştır.

1. Hücre naklinden önce, 3D baskılı yemek borusunu ultraviyole ışık altında 1 saat sterilize edin, 10 dakika etanolile ıslayın ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3 kat yıkayın.
2. Kültür ve büyüme orta (bazal orta / büyüme takviyesi) hMSCs genişletmek. İki katmanlı borulu iskeleler nonadherent 24 kuyu doku kültür plakaları transfer edildi.
3. Hücreleri iskelenin iç yüzeyine takmak için hMSC süspansiyonu büyüme ortamını içeren bazal membran matrisinde 1 x 10⁶ hücre/mL yoğunlukta hafifçe ekleyin.
4. İki katmanlı borulu iskelenin iç yüzeyine aynı şekilde bodrum membran matris süspansiyonuna birikintisi yatırın.
5. HMSC tohumlu boru iskelesini, pulsatil akış biyoreaktör sistemi kullanarak biyoreaktörün kültür odasındaki akrilik tutucuya sıkıca sabitle.
   NOT: Özel olarak tasarlanmış biyoreaktör sistemi bir pompa, kabarcık kapanı, akış odası, basınç göstergesi, kontrol edilebilir vana ve orta rezervuaroluşur. Kültür odasında kesme stresi uygularken, 1-2 dk¹¹dinlenme süresi sağlar.
6. Kültür odasına büyüme ortamı ekleyin ve %5 CO₂¹⁰içeren nemli bir atmosfer altında 0,1 dyne/cm² akışa bağlı kesme gerilimi uygulayın.
   NOT: Akışa bağlı kesme stresinin değeri, insan vücudundan elde edilen özofagus dokusunun peristalsisinin simüle edilerek hesaplanmıştır¹⁰.
7. Üreticinin talimatlarına göre live/DEAD Canlılık Teşp kiti kullanarak 5 gün sonra biyoreaktör ekimi yapılmadan iki katmanlı borulu iskelelerin iç yüzeylerinde hücre yanıtlarını belirleyin. Z-stack aracını kullanarak konfokal mikroskopi ile görüntü alın.
8. Üçüncü gün, taramalı elektron mikroskobu (SEM) aracılığıyla hMSC tohumlu boru iskelesinin yüzey morfolojisini gözlemleyin.
   1. 24 saat için %2,5 glutaraldehit ve OsO4 ile hMSC ile kuluçkaya yatan iskeleyi düzeltin ve etanol ile susuz kalın.
   2. Argon atmosferik koşullarda bir sputter coater kullanarak platin ile sabit hMSCs kat ve 25 kV hızlanan voltajda SEM görüntüleri elde.

3. Hayvan Cerrahisi için Cerrahi Hazırlık

NOT: Hem gastrostomi hem de özofagus transplantasyonu ndan önce cerrahi preparatlar uygulanır.

1. Steril cerrahi aletleri kurun: Neşter bıçak, Weitlaner retraktör, mikroiğne tutucu, mikrosutür forceps, mikrodoku forceps, mikrosisör, Mayo-Hegar iğne tutucu, çalışma makas, iris makas, pansuman, doku forceps, kıymık forceps, iris forceps, 5 mL şırınga (21 G iğne), 10 mL şırınga (22 G iğne), 9-0 poliamid sütür, 4-0 poliglactin sütür.
2. Kiremit/zolazepam (50 mg/g doz) ve %2 ksilazin hidroklorür (2 mg/kg doz) intramüsküler enjeksiyonu ile hayvanı anestezi edin.
   NOT: Özofagus naklinde 398-420 g ağırlığında erişkin Sprague-Dawley (SD) sıçanlar kullanıldı.
3. Cerrahi örtüye geçmeden önce, kuyruk larını çengelle çimdikleyerek hayvanın uygun anestezik durumunu kontrol edin.
4. Hayvanı steril örtüye bir supine pozisyonda yerleştirin ve kılları boyundan (özofagus ekimi için) veya karından (gastrostomi için) çıkarmak için makas kullanın. Sonra betadine ve% 70 etanol ile cerrahi site ovmak.
5. Kesiden önce, ağrı kesici için buprenorfin (0.05-0.1 mg/kg) gibi bir analjezik deri altı enjekte edin.

4. Gastrostomi Cerrahisi Sıçanlarda T-tüp kullanma

NOT: Tüm deneysel hayvanlarda geçici bypass nonoral tüp beslemesi için modifiye gastrostomi yapıldı (n = 5).

1. Ameliyattan bir gün önce fareleri oruçlun. Bölüm 3'te olduğu gibi ameliyat hazırlayın.
2. Anestezi li sıçanların deri ve karın kaslarının orta hat kesisi ile mide maruz.
3. Bir neşter bıçak ile ön mide duvarında 3 mm delik oluşturun.
4. Silikon T-tüpünün ucunu defekt bölgesine takın ve mide duvarına sabitle.
5. T-tüpün mide duvarından ayrılmasın diye düzgün bir şekilde dikiş atın.
6. İmplante edilen T-tüpün distal ucunu subkutan tünelden boynun arkasına doğru götürün.
7. Mide içeriğinin geriye doğru akmasını önlemek için heparin kapağını T-tüpün ucuna takın.
   NOT: T-tüpün ucunu heparin kapağına bağlamak için anjiyokateter kullanın.
8. 4-0 poliglactin sütür kullanarak karın duvarı ve cilt tüm katmanları dikiş.
9. Gastrostomi tamamlandıktan sonra tüm deneysel sıçanları metabolik bir kafeste ayrı tutun.

5. Özofagus Transplantasyonu

NOT: İki katmanlı boru lu iskelenin özofagus nakli gastrostomiden 1 hafta sonra yapılır (n = 5). Transplantasyondan önce, hMSC'leri (hücre yoğunluğu: bazal membran matrisinde 1 x 10⁶ hücre/mL) her iskelenin iç duvarına aşılayın ve biyoreaktör sisteminde 3 gün kuluçkaya yatırın. Cerrahi işlem aşağıdaki gibidir.

1. Model hayvanların boyun kıllarını çıkarın ve aseptik cerrahi için cerrahi alanın standart draping yapmak.
   NOT: Hayvan üzerinde şüpheci cerrahi korumak için büyük bir tıraş alanı oluşturmak önerilir.
2. Boynun anterior median insizyonu sonra, kayış kasları ayırmak ve trakeoözofageal yapısını ortaya çıkarmak.
3. Segmenti kesmeden önce ağız dan vagus sinirini kesip, aksi takdirde hayvanın solunumtehlikeye.
4. Büyütme altında, trakea yemek borusunun sol tarafı izole ve dikkatle tiroid bezinden üst kısmını ayırın.
5. Cerrahi makas kullanarak yemek borusunun tüm katmanlarını içeren 5 mm uzunluğunda tam çevresel defekt oluşturun.
   NOT: Özofagus naklinden önce, hazırlanan iskeleleri, nakil bölgesinin uzunluğuna uyacak şekilde cerrahi makas kullanarak kesin.
6. Mikroskop altında, 9-0 dikiş ipliği kullanarak distal özofagus defektinin her iki ucunda mikroanastomoz yapın. Üst özofagus kalıntısı ve iskelesağ inferoposterior marjı arasında ilk sütür yerleştirin. Üst özofagus kalıntısı ile iskele arasında sağdan sola doğru dikiş atmaya devam edin. Alt yemek borusu kalıntısının üst kenar boşluğu yla aynı şekilde iskeleyi anastomozlayın.
   NOT: Özofagus transplantasyonu için klinik cerrahide kullanılan mikrovasküler anastomoz u yapın. İmplant bölgesinin hassas ve su geçirmez dikişleri için bir mikroskopla çalışın.
7. Daha sonra, greftler için istikrarlı bakım ve vasküler kaynağı sağlamak için nakledilen site üzerinde çevreleyen tiroid bezi flebi yatıyordu.
8. Transplantasyondan sonra deri altı kas ve deri dokusunu 4-0 vicryl sütür ile dikin.
9. Tüm deneysel sıçanları tek tek metabolik kafeslerde tutun.

6. Ameliyat sonrası prosedürler

NOT: Postoperatif işlemler hem gastrostomi hem de özofagus transplantasyonu sonrası yapılır.

1. Karın yarası kapatıldıktan sonra, bireysel metabolik kafesler içine sıçan koymak ve hipotermi önlemek için kızılötesi ısınma cihazları üzerine kafesler yerleştirin.
2. Onlar elde edene kadar hayvanları izlemek ve sternal recumbency korumak (yani, göğüs üzerinde dik yatarken).
3. Cerrahi bölgede iltihabı en aza indirmek için, antibiyotik gentamisin (20 mg / kg) sıçanlara günlük uygulayın.
4. Çalışmanın bitiş noktasına kadar üçüncü postoperatif günde oral sıvı beslemeye başlayın. Tüm beslenme formülünü (20.6 g/100 ml [g%] karbonhidrat, %3.8 protein, %0.2 gr yağ) ameliyattan sonra güne başlayan heparin kapağı ile günde 3kat tedarik edin.
5. Hayvanların görünümünü ve vücut ağırlığını her gün kontrol edin. Kendine zarar veren kesi bölgesi veya tüp alımına karşı direnç gibi davranışların yanı sıra çeşitli cerrahi komplikasyonları yönetin. Sıçan modellerinin vücut ağırlığı hızla azaldığında 20% veya daha fazla, CO₂ inhalasyon ile ötenazi gerçekleştirin.

7. Histoloji ve immünohistokimya

NOT: Histolojik analiz için ötanazi yapılan hayvanların özofagus dokusunun tamamı cerrahi makas kullanılarak elde edilir. Hematoksilin ve eozin boyama ve Masson'un trikrom boyama sı standart histolojik teknikler kullanılarak yapıldı. İmmünohistokimya aşağıdaki protokole göre yapıldı.

1. Nakledilen bölgeleri içeren tüm yemek borusunu %4 paraformaldehitle düzeltin. Bir parafin bloğu oluşturun ve 4 μm kalınlığında kesin.
2. Doku bölümlerini deparafinize ve bir etanol serisi onları dehydrate. Sitrat tampon ve mikrodalga 10 dakika boyunca ısı doku slaytlar batırın. Hücreleri 20 dk soğuk PBS ile soğutun. 6 dk için %3 hidrojen peroksit batırın ve 10 dk PBS ile yıkayın.
3. Doku bölümlerinin nonspesifik reaksiyonlarını engellemek için oda sıcaklığında 1 saat boyunca %3 büyükbaş serum albumin (BSA) inkübül.
4. 5 dk. Desmin (1:200'e seyreltilmiş), keratin 13 (1:100'e seyreltilmiş) ve von Willebrand Factor (vWF; 1:100'e seyreltilmiş) 4 °C'de bir gecede primer antikorlarla 3 kat Yıkayın.
5. 15 dakika PBS ile 3x yıkayın. Oda sıcaklığında Desmin ve Keratin 13 için 1:500 konsantrasyonda uygun ikincil antikor ile incubate. Daha sonra slaytları PBS ile iki kez 10 dakika yıkayın.
   NOT: vWF için doku bölümleri horseradish peroksidaz konjuge kit kullanılarak inkübe edildi (Malzeme Tablosunabakınız) ve daha sonra 3,3'-diaminobenzidin (DAB) kullanılarak görselleştirildi.
6. Montaj ortamı içeren bir cam kapak ve 4',6-diamidino-2-fenolindole (DAPI) kullanarak monte.

Sonuçlar

Şekil 1, PU-PCL iki katmanlı borulu iskelenin üretim sürecinin şematik diyagramını göstermektedir. PU çözeltisi 18 G iğneden 200 μm kalınlığında silindirik bir iç yapı yapmak için elektrospun edildi. Daha sonra, erimiş PCL düzenli aralıklarla PU nanofiber dış duvarına basıldı. Tamamlanmış boru iskelesinin iç ve dış duvarlarının yüzey morfolojisi taramalı elektron mikroskopi görüntülerinde görülebilir.

Tartışmalar

Yapay özofaji üzerinde mevcut hayvan çalışmaları hala çeşitli kritik faktörler ile sınırlıdır. İdeal yapay özofagus iskelesi biyouyumlu olmalı ve mükemmel fiziksel özelliklere sahip olmalıdır. Anastomoz sızıntısını önlemek için erken postoperatif dönemde mukozal epiteli yenileyebilmeli. İç dairesel ve dış boylamsal kas tabakalarının yenilenmesi de fonksiyonel peristalsis için önemlidir^12,13.

Yemek bo...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Metabolic cage	TEUNGDO BIO & PLANT	JD-C-66
Zoletil (50 mg/g dose)	Virbac	1000000188
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
1 mL Syringe	BD	309659
2% xylazine hydrochloride (Rumpun)	Byely	Q-0615-035
4% paraformaldehyde	BIOSOLUTION	BP031
4-0 Vicryl	ETHICON	W9443
9-0 Vicryl	ETHICON	W2813
Antibiotic gentamicin (Septopal).	Septopal	0409-1207-03
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	5470
Citrate Buffer, ph6.0, 10X	Sigma	C9999
DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT	VECTOR	SK4100
Desmin	Santa Cruz	sc-23879
Elastic stain kit	ScyTeK	ETS-1
Ethanol	Merck	100983
Ethanol	Merck	64-17-5
Fetal Bovine Serun (FBS)	Gibco	16000-044
Glutaraldehyde	Sigma	354400
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A-11001
Heparin cap	Hyupsung Medical	HS-T-05
hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM)	Invitrogen	R7788-110
Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain)	VECTOR	PK7800
Hydrogen peroxide	JUNSEI	7722-84-1
Keratin13	Novus	NBP1-97797
LIVE/DEAD Viability Assay Kit	Molecular Probes	L3224
Matrigel	Corning	354262
N,N-dimethylformamide (DMF)	Sigma	227056
Nonadherent 24-well tissue culture plates.	Corning	3738
OsO4	Sigma	O5500
Petri dish	Eppendorf	3072115
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010-023
Phosphate-buffered saline (PBS), 10X	BIOSOLUTION	BP007a
Polycaprolactone (PCL) polymer	Sigma	440744
Polyurethane (PU+A2:A24) polymer	Lubrizol	2363-80AE
Power Supply	NanoNC	HV100
ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36931
Rumpun	Bayer	Q-0615-035
Silicone T-tube	Sewoon Medical	2206-005
Terramycin Eye Ointment	Pfizer Pharmaceutical Korea	W01890011
Tiletamine/Zolazepam (Zoletil)	Virbac Laboratories	Q-0042-058
Trichrome stain kit	ScyTeK	TRM-1
von Willebrand Factor (vWF)	Santa Cruz	sc 14014