Hochfrequenz-Ultraschall-Echokardiographie zur Beurteilung der Herzfunktion von Zebrafischen

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur Beurteilung der Herzmorphologie und -funktion bei erwachsenen Zebrafischen mittels hochfrequenter Echokardiographie. Die Methode ermöglicht die Visualisierung des Herzens und die anschließende Quantifizierung von funktionellen Parametern wie Herzfrequenz (HR), Herzleistung (CO), Bruchflächenänderung (FAC), Auswurffraktion (EF) sowie Blutzufluss- und Abflussgeschwindigkeiten.

Zusammenfassung

Der Zebrafisch (Danio rerio) hat sich zu einem sehr beliebten Modellorganismus in der kardiovaskulären Forschung, einschließlich menschlicher Herzkrankheiten, vor allem aufgrund seiner embryonalen Transparenz, genetischen Traktionsfähigkeit und Annehmlichkeiten für schnelle, Hochdurchsatzstudien. Der Verlust der Transparenz schränkt jedoch die Herzfunktionsanalyse im Erwachsenenstadium ein, was die Modellierung altersbedingter Herzerkrankungen erschwert. Um solche Einschränkungen zu überwinden, entwickelt sich die hochfrequente Ultraschall-Echokardiographie bei Zebrafischen als praktikable Option. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Beurteilung der Herzfunktion bei erwachsenen Zebrafischen durch nichtinvasive Echokardiographie mittels Hochfrequenz-Ultraschall vor. Die Methode ermöglicht die Visualisierung und Analyse der Zebrafischherzdimension und Quantifizierung wichtiger funktioneller Parameter, einschließlich Herzfrequenz, Schlaganfallvolumen, Herzleistung und Auswurffraktion. Bei dieser Methode werden die Fische beästhebt und unter Wasser gehalten und können nach dem Eingriff geborgen werden. Obwohl Hochfrequenz-Ultraschall eine teure Technologie ist, kann die gleiche Bildgebungsplattform für verschiedene Arten (z. B. Murin und Zebrafisch) verwendet werden, indem verschiedene Messumformer angepasst werden. Zebrafish-Echokardiographie ist eine robuste Methode zur kardialen Phänotypisierung, die bei der Validierung und Charakterisierung von Krankheitsmodellen, insbesondere spät auftretenden Krankheiten, nützlich ist; Drogen-Bildschirme; und Studien über Herzverletzungen, Genesung und Regenerationsfähigkeit.

Einleitung

Der Zebrafisch (Danio rerio) ist ein etabliertes Wirbeltiermodell für Studien von Entwicklungsprozessen und menschlichen Krankheiten¹. Zebrafische haben eine hohe genetische Ähnlichkeit mit Menschen (70%), genetische Traktionsfähigkeit, hohe Fruchtbarkeit und optische Transparenz während der embryonalen Entwicklung, die eine direkte visuelle Analyse von Organen und Geweben, einschließlich des Herzens, ermöglicht. Obwohl das Zebrafischherz nur über ein Atrium und einen Ventrikel verfügt (Abbildung 1), ist es physiologisch ähnlich wie Säugetier-Vierkammerherzen. Wichtig ist, dass die Herzfrequenz des Zebrafisches, die Elektrokardiogrammmorphologie und die Wirkungspotentialform denen des Menschen mehr ähneln als die murinen Arten². Diese Eigenschaften haben Zebrafische zu einem ausgezeichneten Modell für die Kardiovaskuläre Forschung gemacht und haben wichtige Einblicke in die Herzentwicklung^3,4, Regeneration⁵und pathologische Bedingungen^1,3,4, einschließlich Arteriosklerose, Kardiomyopathien, Arrhythmien, angeborene Herzkrankheiten, und Amyloid Lichtkettenkardiotoxizität^1,4,6. Die Beurteilung der Herzfunktion war während des embryonalen Stadiums (1 Tage nach der Befruchtung) durch direkte Videoanalyse mittels Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie^7,8möglich. Zebrafische verlieren jedoch ihre Transparenz über das embryonale Stadium hinaus und begrenzen die funktionelle Bewertung normaler reifer Herzen und spät einsetzten Herzerkrankungen. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde die Echokardiographie erfolgreich als hochauflösende, echtzeitfreie, nichtinvasive bildgebende Alternative zur Bewertung der Erwachsenen-Zebrafisch-Herzfunktion^{9,10,11,12,13,14,15}eingesetzt.

Bei Zebrafischen befindet sich das Herz ventral in der Brusthöhle unmittelbar nach dem Ende der Kiemen mit dem Atrium dorsal zum Ventrikel. Das Atrium sammelt venöses Blut aus dem Sinus venosus und überträgt es in den Ventrikel, wo es weiter zum bulbus arteriosus gepumpt wird (Abbildung 1). Hier beschreiben wir ein physiologisches, Unterwasserprotokoll zur Beurteilung der Herzfunktion bei erwachsenen Zebrafischen durch nicht-invasive Echokardiographie mit einer linearen Array-Ultraschallsonde mit einer Mittelfrequenz von 50 MHz für die B-Modus-Bildgebung mit einer Auflösung von 30 m. Da Ultraschallwellen leicht durch Wasser wandern können, bietet die Nähe zwischen den Fischen und der Scansonde unter Wasser genügend Kontaktfläche für die Herzerkennung ohne Ultraschallgel und ist insgesamt weniger belastend für die Fische. Obwohl alternative Zebrafisch-Echokardiographie-Systeme von mehreren Autoren^9,12,13berichtet wurden, stellen wir hier die allgemeine und am häufigsten verwendete Einrichtung vor, die für Hochfrequenz-Ultraschall bei Tieren gilt.

Die Methode ermöglicht eine hochauflösende Bildgebung des erwachsenen Zebrafischherzes, die Rückverfolgung von Herzstrukturen und die Quantifizierung von Spitzengeschwindigkeiten aus Doppler-Blutflussmessungen. Wir zeigen eine zuverlässige In-vivo-Quantifizierung wichtiger systolischer und diastolischer Parameter wie Auswurffraktion (EF), Bruchflächenänderung (FAC), ventrikuläre Blutzufluss- und Abflussgeschwindigkeiten, Herzfrequenz (HR) und Herzleistung (CO). Wir tragen dazu bei, ein zuverlässiges Sortiment an normalen gesunden erwachsenen Zebrafischen kardialen funktionellen und dimensionalen Parametern zu etablieren, um eine genauere Bewertung der pathologischen Zustände zu ermöglichen. Insgesamt bieten wir eine robuste Methode zur Beurteilung der Herzfunktion bei Zebrafischen, die sich bei der Etablierung und Validierung von Zebrafisch-Herzkrankheitsmodellen^6,16, Herzverletzungen und Genesung^10,13und Regeneration^11,12als äußerst nützlich erwiesen hat und weiter zur Bewertung potenzieller Medikamente eingesetzt werden kann.

Protokoll

Alle Verfahren mit Zebrafischen wurden von unserem Institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss genehmigt und entsprechen dem USDA Animal Welfare Act.

1. Versuchsaufbau

1. Einrichten der Plattform für die Bildaufnahme
   1. Mit einer kleinen Schere oder einem Skalpell machen Einen Schnitt auf einen Schwamm an der 12-Uhr-Position, um den Fisch während des Scannens zu halten. Legen Sie den Schwamm in einen Glasbehälter (Abbildung 2A).
      HINWEIS: Die Position des Einschnitts sollte genügend Raum zum Bewegen des Messumformers lassen und auch die Fische an der Wasserlinie halten, wenn die Plattform zum Scannen geneigt ist (Abbildung 2). Der Schnitt kann je nach Größe des Fisches variieren; Bei einer Standardgröße und einem Standardgewicht sollte der Schnitt jedoch ca. 2,5 cm x 0,7 cm x 0,5 cm (Länge, Breite bzw. Tiefe) betragen. Der Glasbehälter sollte mindestens 6 cm tief sein, um Wasseraustritt eingme, während die Fische gebildert werden.
   2. Befestigen Sie den Glaskasten mit dem Schwamm auf der Ultraschallplattform, z. B. mit doppelseitigem Klebeband. Stellen Sie sicher, dass sich der Glaskasten in der Mitte der Plattform befindet und fest befestigt ist (Abbildung 2B).
   3. Neigen Sie die Plattform mit dem Knopf auf der linken Seite des Plattformhalters um ca. 30° nach vorne (Abbildung 2B). Füllen Sie das Glasquadrat mit 200-250 ml Fischsystemwasser, das 0,2 mg/ml Tricainmetmetsulfonat (MS222) enthält.
      HINWEIS: Tricain kann als 4 mg/ml-Stammlösung in Tris 40 mM pH 7 hergestellt und weiter auf die gewünschte Konzentration im Fischsystemwasser verdünnt werden; 0,2 mg/ml war die beste Konzentration¹⁶. Die 4 mg/ml Tricain-Stammlösung kann über einen längeren Zeitraum bei -20 °C oder einen Monat bei 4 °C gelagert werden.
   4. Stecken Sie den Messumformer in den Mikromanipulatorhalter am arbeitsfähigen Bahnhof, und drehen Sie die Kerbe des Messumformers in Richtung des Bedieners. Halten Sie das Array parallel zum Boden mit der Arbeitsseite Längsinal in Bezug auf die Bühne (siehe Abbildung 2B). Lassen Sie genügend Platz (10 cm beidseitig) für das nun angeschlossene Wandler-Schienensystem, um sich entlang der x- und y-Achsen zu bewegen.
   5. Melden Sie sich bei der Steuerungssoftware an und wählen Sie Mouse (Small) Vascular. Erstellen Sie eine neue Studie sowie eine neue Serie für jedes In der Studie enthaltene Tier. Suchen Sie die neue Schaltfläche für die Studie auf der unteren linken Seite des Bildschirms auf der Browserseite (die Ansicht beginnt im B-Modus).

2. Umgang mit dem Fisch

HINWEIS: Zebrafische, die in dieser Studie verwendet wurden, waren erwachsene, 11 Monate alte Männchen der Wildsorte AB/Tuebingen (AB/TU). Zebrafische wurden in einem eigenständigen Durchflussaquariumsystem bei 28 °C in einem konstanten Lichtzyklus als 14 h hell/10 h dunkel gehalten. Zebrafische wurden zweimal täglich mit Solegarnelen (Artemia nauplii) und Trockenfutterflocken gefüttert.

1. Mit einem Fischnetz die Fische in einen kleinen Tank mit Systemwasser mit 0,2 mg/ml Tricain geben. Warten Sie, bis der Fisch vollständig beästhetisiert ist (keine Bewegung und keine Reaktion auf Berührung).
2. Mit einem Plastik-Teelöffel, sanft und schnell übertragen sie den Fisch in die Glasbox mit dem Schwamm in den zuvor gemachten Schnitt mit ventraler Seite des Fisches nach oben.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Fisches in Richtung des Bedieners positioniert ist (gleiche Richtung wie die Kerbe des Messumformers) und auf einem etwas höheren Niveau im Vergleich zum Rest des Körpers, um eine bessere Herzvisualisierung zu erreichen.
3. Senken Sie den Messumformer (unter Beibehaltung seiner ursprünglichen Position) vorsichtig mit dem Griff auf dem Schienensystem, indem Sie ihn längs und nahe an der ventralen Seite des Fisches platzieren, wobei die Kerbe des Messumformers dem Bediener zugewandt ist. Lassen Sie 2-3 mm (nicht mehr als 1 cm) Abstand von den Fischen. Passen Sie die Plattform in Bezug auf den Messumformer mit dem Mikromanipulator in allen 3 Achsen an, bis das Fischherz visualisiert ist, und starten Sie dann die Bildaufnahme. Der Winkel des Messumformers sollte während der gesamten Bildaufnahme nicht geändert werden (Abbildung 2C).
   HINWEIS: Solange genügend Nähe (bis zu 1 cm) vorhanden ist, sorgt das Wasser auf dem Fisch über eine flüssige Oberflächenspannung, die die Übertragung der Ultraschallwellen zwischen Sonde und Fisch ermöglicht. Daher besteht keine Notwendigkeit, den Messumformer gegen den Fisch zu schieben. Versuchen Sie, diesen Schritt abzuschließen und den Scan in weniger als 3 Minuten zu beenden, um den Fischtod oder eine Abnahme der Herzfrequenz während der Bildaufnahme zu verhindern. Verwenden Sie bei Bedarf einen Timer. Das Herz befindet sich auf der Oberseite des Bildschirms zur linken Seite des Auges, was leicht visualisiert werden kann, wenn man die x-Achse bis nach rechts bewegt. Wenn es weiterhin Schwierigkeiten gibt, das Herz im B-Modus zu finden, wechseln Sie in den Farb-Doppler-Modus, der die Verfolgung des Blutflusses (rot zeigt Blut, das in Richtung des Bedieners fließt) und das Auffinden des Herzens ermöglicht.

3. Bildaufnahme

HINWEIS: Siehe Tabelle der Materialien für Bildgebungssystem und Bildanalyse-Software.

1. Längsansicht B-Modus
   1. Nach der Lokalisierung des Herzens wählen Sie oder bleiben Sie im B-Modus (gefunden auf der unteren linken Seite des Touchscreens, nachdem Sie eine neue Serie initiiert haben) und reduzieren Sie das Feld, um zu vergrößern und einen genaueren Blick auf das Herz zu werfen, um die Verfolgung während der Analyse zu erleichtern.
   2. Um eine engere und klarere Sicht auf das Herz in der B-Mode-Bildaufnahme zu haben, reduzieren Sie das Feld durch Zoomen. Verwenden Sie den Touchscreen, um das Feld sowohl auf der x- als auch auf der y-Achse manuell einzugrenzen.
   3. Verbessern Sie bei Bedarf die Qualität/kontrastreich des Bildes, indem Sie den Dynamikbereich auf 45-50 dB einstellen. Wechseln Sie zu den B-Modus-Steuerelementen in der Option Mehr Steuerelemente, und speichern Sie anschließend die Änderung in Mode-Presets. Tippen Sie auf Modusvoreinstellungen, um die optimierte Bildaufnahmeeinstellung jedes Mal auszuwählen, bevor Sie mit dem Abbild einer neuen Serie beginnen.
   4. Nehmen Sie so viele Bilder wie gewünscht in der langen Achsenebene auf, indem Sie Bild speichernauswählen.
      HINWEIS: Ausführlichere Informationen und Schulungsressourcen zur Bildaufnahme finden Sie unter https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab und https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
2. Längsansicht Pulswelle
   1. Wechseln Sie zu Color Doppler für die Blutflusserkennung (Wählen Sie Farbe Taste) und Erfassung (finden Sie auf der unteren linken Seite des Touchscreens, nachdem Sie eine neue Serie initiiert haben).
   2. Positionieren Sie den Quadranten über dem atrioventrikulären Ventil über dem Touchscreen und lokalisieren Sie den Zufluss, der durch das rote Farbsignal unterschieden wird (Abbildung 3A). Reduzieren Sie den Quadrantenbereich so weit wie möglich, um die Bildrate zu erhöhen.
      HINWEIS: Senken Sie die Farbpuls-Wiederholungsfrequenz (Farbe PRF) (Geschwindigkeitsbereich), um sicherzustellen, dass gelbe Farbe im Geschwindigkeitsprofil des Farbdopplerbildes angezeigt werden kann. Dies wird den Bereich der Geschwindigkeiten erhöhen, die gesehen werden können, und wird dazu beitragen, ein Mosaik der Farbe zu schaffen, die es ermöglichen, die Spitzengeschwindigkeiten klarer zu visualisieren.
   3. Aktivieren Sie die Pulswelle (wählen Sie PW) Doppler-Modus, um die ventrikuläre Blutzuflussgeschwindigkeit zu testen. Positionieren Sie das Probenvolumentor in der Mitte des atrioventrikulären Ventils (wo das rote Farbsignal gelblich wird), um die maximale Strömungsgeschwindigkeit zu erkennen. Passen Sie den PW-Winkel auf dem Bildschirm mit den Fingern so an, dass er sich an der Richtung des Blutzuflusses ausrichtet. Drücken Sie Start oder Update, um mit der Probenahme der Geschwindigkeit des Blutes zu beginnen, das in den Ventrikel fließt.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die winkelkorrekte Linie parallel zum Blutfluss ist, um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Wenn Sie die richtige Winkellinie so platzieren, dass sie der Richtung des Blutflusses entspricht, wird sichergestellt, dass die Geschwindigkeiten genau erfasst werden.
   4. Wiederholen Sie Schritt 3.2.3, um die Abflussgeschwindigkeit zu bestimmen, indem Sie den Color Doppler Quadranten an der Kreuzung zwischen dem Ventrikel und dem Bulbus (bulbuventritrikuläres Ventil) platzieren und den Durchfluss lokalisieren, der durch ein blaues Farbsignal unterschieden wird (Abbildung 3B). Positionieren Sie das Probenvolumentor direkt vor dem Ventrikel-Bulbus-Knoten, und passen Sie die Winkelkorrekturlinie an die Richtung des Blutflusses an.
      HINWEIS: Um genaue Geschwindigkeitswerte zu erreichen, stellen Sie sicher, dass der PW-Winkel am Blutfluss ausgerichtet ist.
   5. Passen Sie die Basislinie (bar) an, senken oder erhöhen Sie sie im Strömungsgeschwindigkeitsbedienfeld, um die Signalspitzen vollständig zu erkennen und zu verfolgen (Abbildung 3C,D). Identifizieren Sie die Zuflussspitzen im oberen/positiven Quadranten (Signal, das in Richtung Sonde geht) und die Abflussspitzen im unteren/negativen Quadranten (Signal, das von der Sonde weggeht).

4. Fischrückgewinnung

1. Sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, mit einem Teelöffel, übertragen Sie die Fische in regelmäßiges System belüftet Wasser frei von Tricain und lassen Sie die Fische erholen (in der Regel dauert 30 s bis 2 min, um Kiemenbewegung und Schwimmen wieder aufzunehmen).
2. Um die Erholung zu unterstützen, spritzen Sie wasser wiederholt über die Kiemen mit einer Transferpipette, um die Belüftung des Wassers und sauerstoffübertragens zu fördern.

5. Bildanalyse

1. Öffnen Sie die Bildanalysesoftware.
2. Wählen Sie ein Bild aus und klicken Sie auf das Bildverarbeitungssymbol (Abbildung 4). Passen Sie mit der verfügbaren Skala (Abbildung 4) Helligkeit und Kontrast des Bildes an, um eine klare Visualisierung von ventrikulären Wänden oder Blutflussmustern zu ermöglichen.
3. Öffnen Sie mit dem B-Modus-Bild die Dropdown-Liste der Option PSLAX (parasternale Langachse) auf dem Herzpaket/den Herzmessungen (Abbildung 4). Wählen Sie LV-Spuren und -Spuren der ventrikulären Innenwand bei Systole und Diastole, um den ventrikulären Bereich (VA) in Systole (VAs) und Diastole (VAd), Enddiastolisches Volumen (EDV) und End-Systolisches Volumen (ESV) zu erhalten (Abbildung 5A,B).
   HINWEIS: Volumenwerte werden von 2D-Bildverfolgungen extrapoliert und können von der 3D-Entität abweichen. Für alle Messungen durchschnittlich mindestens 3 repräsentative Herzzyklen pro Tier.
4. Beachten Sie das Hubvolumen und den Auswurfanteil, der automatisch von der Software berechnet und angezeigt wird.
   ANMERKUNG: Hubvolumen und Auswurffraktion können auch manuell mit den Formeln berechnet werden
   SV = EDV-ESV
   EF = (EDV-ESV)/EDV
   wobei SV Strichvolumen, EDV Enddiastolisches Volumen, ESV ist End-Systolisches Volumen und EF eine Auswurffraktion ist
5. Berechnen der Bruchflächenänderung mit der Formel
   FAC = (VAd - VAs)/ VAd
   wobei FAC eine fraktionierte Flächenänderung ist, VAd ein ventrikulärer Bereich in Diastole und VAs ein ventrikulärer Bereich in Systole ist.
6. Berechnen Sie die Herzleistung mit der Formel
   CO = HR x SV
   wobei CO die Herzleistung, HR die Herzfrequenz und SV das Schlaganfallvolumen ist
7. Messen Sie mithilfe des Pulsed Wave Doppler Mode-Bildes die Blutdurchblutungsgeschwindigkeit, indem Sie die Option MV Flow unter dem Herzpaket auswählen (Abbildung 4). Wählen Sie E oder A für frühe Diastole bzw. Spätdiastole aus, und bestimmen Sie die Spitzengeschwindigkeiten im Diagramm (Abbildung 3C).
8. Messen Sie die Blutgeschwindigkeit des Abflusses, indem Sie AoV Flow auswählen und die Spitzen auf der Ablaufverfolgung bestimmen (Abbildung 3D).
9. Messen Sie die Herzfrequenz anhand von 2 verschiedenen Methoden für eine zuverlässigere Bewertung:
   1. Wenn das Herz während der Bildaufnahme auf dem Bildschirm visualisiert wird, zählen Sie die Beats innerhalb von 10 s und multiplizieren Sie sie mit 6.
   2. Wählen Sie mit dem Pulswellen-Doppler-Bild in der Vevo LAB-Software die Herzfrequenztaste und die Ablaufverfolgungsintervalle zwischen 3 aufeinanderfolgenden Aortenstromspitzen aus (Abbildung 4 und Abbildung 6).
   3. Um Daten in eine Kalkulationstabelle zu exportieren, nachdem Sie die LV und die Spitzen des Blutflusses verfolgt haben, klicken Sie auf Bericht | export | save as | excel.

Ergebnisse

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Messung wichtiger kardialer Dimensions- und Funktionsparameter, analog zur Technik der menschlichen und tierischen Echokardiographie. Die B-Mode-Bilder ermöglichen die Rückverfolgung der ventrikulären Innenwand in Systole und Diastole (Abbildung 5) und das Abrufen von Dimensionsdaten, wie Kammer- und Wandabmessungen, und funktionelledaten wie Herzfrequenz, Hubvolumen und Herzleistung sowie Parameter der ventrikul?...

Diskussion

Wir beschreiben eine systematische Methode zur echokardiographischen Bildgebung und Beurteilung der Herzfunktion bei erwachsenen Zebrafischen. Echokardiographie ist die einzige verfügbare nicht-invasive und robusteste Methode für lebende erwachsene Fische Kardialbildgebung und funktionelle Analyse, und es wird immer beliebter in Zebrafisch Herz-Kreislauf-Forschung. Der benötigte Zeitaufwand ist kurz und ermöglicht Hochdurchsatz- und Längsuntersuchungen. Die angewandte Methodik und die Datenanalyse sind jedoch sehr u...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double sided tape
Fish net
Glass container - 100 inch high
High frequency transducer	Fujifilm/VisualSonics	MX700	Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm
Plastic teaspoon
Scalpel or scissors
Small fish tanks
Sponge (kitchen sponge)
Transfer pipets (graduated 3 mL)	Samco Scientific	212
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	A5040
Vevo 3100 Imaging system and imaging station	Fujifilm/VisualSonics
Vevo LAB sofware v 1.7.1	Fujifilm/VisualSonics