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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui vengono presentati i metodi per comprendere gli effetti anti-cancro del surnatante senza cellule di Lactobacillus (LCFS). Le linee cellulari del cancro del colon-retto mostrano decessi cellulari quando trattati con LCFS in colture 3D. Il processo di generazione degli sferoidi può essere ottimizzato a seconda dell'impalcatura e i metodi di analisi presentati sono utili per valutare le vie di segnalazione coinvolte.

Abstract

Questo manoscritto descrive un protocollo per valutare le morti delle cellule tumorali in sferoidi tridimensionali (3D) di tipi multicellulari di cellule tumorali utilizzando supernatanti da coltura cellulare di Lactobacillus fermentum , considerati come colture probiotiche. L'uso di colture 3D per testare il surnatante privo di cellule di Lactobacillus (LCFS) è un'opzione migliore rispetto al test in monostrati 2D, soprattutto perché L. fermentum può produrre effetti anti-cancro all'interno dell'intestino. L. fermentum supernatant è stato identificato per possedere un aumento degli effetti anti-proliferativi contro diverse cellule del cancro del colon-retto (CRC) in condizioni di coltura 3D. È interessante notare che questi effetti erano fortemente correlati al modello di coltura, dimostrando la notevole capacità di L. fermentum di indurre la morte delle cellule tumorali. Gli sferoidi stabili sono stati generati da diversi CRC (cellule tumorali del colon-retto) utilizzando il protocollo presentato di seguito. Questo protocollo di generazione di sferoidi 3D consente di risparmiare tempo ed è conveniente. Questo sistema è stato sviluppato per studiare facilmente gli effetti anti-cancro di LCFS in più tipi di sferoidi CRC. Come previsto, gli sferoidi CRC trattati con LCFS hanno fortemente indotto la morte cellulare durante l'esperimento ed espresso specifici marcatori molecolari di apoptosi analizzati mediante qRT-PCR, western blotting e analisi FACS. Pertanto, questo metodo è prezioso per esplorare la vitalità cellulare e valutare l'efficacia dei farmaci anti-cancro.

Introduzione

I probiotici sono i microrganismi più vantaggiosi nell'intestino che migliorano l'omeostasi immunitaria e il metabolismo energetico dell'ospite1. I probiotici di Lactobacillus e Bifidobacterium sono i più avanzati del suo genere trovati nell'intestino2,3. Precedenti indagini hanno dimostrato che Lactobacillus ha effetti inibitori e antiproliferativi su diversi tumori, tra cui il cancro delcolon-retto 4. Inoltre, i probiotici prevengono le malattie infiammatorie intestinali, il morbo di Crohn e la colite ulcerosa5,6. Tuttavia, la maggior parte degli studi con probiotici sono stati eseguiti in monostrati bidimensionali (2D) che vengono coltivati su superfici solide.

I sistemi di coltura artificiale mancano di caratteristiche ambientali, il che non è naturale per le cellule tumorali. Per superare questa limitazione, sono stati sviluppati sistemi di coltura tridimensionali (3D)7,8. Le cellule tumorali in 3D mostrano miglioramenti in termini di meccanismi biologici di base, come la vitalità cellulare, la proliferazione, la morfologia, la comunicazione cellula-cellula, la sensibilità ai farmaci e la rilevanza in vivo9,10. Inoltre, gli sferoidi sono costituiti da tipi multicellulari di cancro del colon-retto e dipendono dalle interazioni cellula-cellula e dalla matrice extracellulare (ECM)11. Il nostro studio precedente ha riportato che il surnatante probiotico privo di cellule (CFS) prodotto utilizzando Lactobacillus fermentum ha mostrato effetti anti-cancro su colture 3D di cellule di cancro del colon-retto (CRC)12. Abbiamo proposto che la CFS sia una strategia alternativa adatta per testare gli effetti probiotici sugli sferoidi 3D12.

Qui, presentiamo un approccio che può ospitare tipi multicellulari di cancro del colon-retto 3D per l'analisi degli effetti terapeutici del surnatante probiotico senza cellule (CFS) su diversi sistemi di mimetismo del cancro del colon-retto 3D. Questo metodo fornisce un mezzo per l'analisi degli effetti probiotici e anti-cancro correlati in vitro.

Protocollo

1. Colture cellulari batteriche e preparazione di Lactobacillus cell-free surnatante (LCFS)

NOTA: I passaggi 1.2 – 1.9 sono condotti in una camera anaerobica.

  1. Preparare una piastra di agar MRS e un brodo contenente L-cisteina e sterilizzare in autoclave.
  2. Pre-incubare la piastra di agar MRS in camera anaerobica H2 mantenuta a 37 °C con 20 ppm di ossigeno.
  3. Scongelare lo stock batterico di Lactobacillus e inoculare la piastra di agar con la coltura batterica (Figura 1A (i)).
  4. Incubare i batteri per 2 - 3 giorni in camera anaerobica H2 a 37 °C e 20 ppm di ossigeno fino ad ottenere singole colonie batteriche.
  5. Lavare e asciugare il tubo di coltura anerobica di tipo Hungate. Autoclave del tubo di coltura a 121 °C per 15 min.
  6. Quindi incubare il tubo in camera anaerobica H2 a 37 °C e 20 ppm di ossigeno per rimuovere l'ossigeno.
  7. Posizionare 2 - 3 ml di brodo MRS nel tubo. Sigillare il tubo con un tappo di gomma butilica e avvitare il cappuccio.
  8. Ottenere una singola colonia con un anello e posizionarla nel tubo di coltura da 1,5 ml con 500 μL di 1x PBS. (Figura 1A (ii)).
  9. Sospendere la colonia utilizzando una siringa da 1 mL (Figura 1A (iii)). Farlo inserendo l'ago della siringa da 1 mL al centro del coperchio del tubo, aspirando la colonia sospesa e quindi riutilizzandola nel mezzo di brodo MRS. (Figura 1A (iv)).
  10. Incubare il mezzo di brodo MRS in un incubatore shaker per 2 giorni (37 °C, 5% CO2, 200 rpm).
  11. Misurare la densità ottica (OD) utilizzando uno spettrofotometro per monitorare le curve di crescita batterica fino a quando l'assorbanza a OD620 raggiunge 2.0.
  12. Separare il pellet batterico e il mezzo condizionato centrifugando a 1.000 x g per 15 min. Lavare i pellet batterici raccolti con 1x PBS e riconsesporre in 4 ml di RPMI 1640 integrato con il 10% di siero bovino fetale. Non includere antibiotici nel mezzo.
  13. Mantenere i pellet batterici in RPMI e incubare in un incubatore shaker per 4 ore a 37 °C con il 5% di CO2 ad una velocità di 100 rpm.
  14. Per la preparazione del surnatante probiotico, rimuovere il pellet batterico tramite centrifugazione a 1000 x g,per 15 min a 4 °C. Filtrare sterile il surnatante recuperato utilizzando un filtro da 0,22 μm e conservare a -80 °C fino all'uso.

2. Generazione di sferoidi

  1. Preparazione delle linee cellulari del cancro del colon-retto
    1. Coltivare linee cellulari DLD-1, HT-29 e WiDr come monostrati fino al 70-80% di confluenza e incubare la piastra a 37 °C in un incubatore co2 al 5% (terreno di crescita: RPMI contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina).
    2. Per le cellule coltivate in una capsula di Petri da 100 mm, lavare la piastra due volte con 4 ml di 1x PBS. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% e incubare la capsula di Petri per 2 minuti a 37 °C in un incubatore a CO2 al 5% per dissociare le cellule.
    3. Dopo l'incubazione, verificare la dissociazione cellulare al microscopio e neutralizzare la tripsina-EDTA con 5 ml di terreno di coltura.
    4. Trasferire le cellule dissociate in un tubo conico da 15 ml e centrifugare per 3 minuti a 300 x g.
    5. Scartare il surnatante e risospentare delicatamente con 3 ml di terreno di crescita.
    6. Contare le cellule con tripano blu per determinare le cellule vitali usando un emocitometro. (Figura 1B (i))
  2. Formazione sferoide
    1. In un tubo conico da 15 mL, diluire le cellule da 2.1.5 per ottenere 1 - 2 x 105 celle/mL (Figura 1B (ii))
    2. Aggiungere la concentrazione finale dello 0,6% di metilcellulosa alla sospensione cellulare e trasferire le cellule diluite in un serbatoio sterile.
      NOTA: Per ogni linea cellulare, la quantità di metilcellulosa necessaria deve essere titolata e determinata di conseguenza.
    3. Utilizzare una pipetta multicanale per erogare 200 μL di celle a ciascun pozzera di una micropiastra a fondo tondo a 96 pozzette con attacco ultra-basso. (Figura 1B (iii))
    4. Incubare la piastra a 37 °C in un incubatore a CO2 al 5% per 24 - 36 ore.
    5. Dopo 24 - 36 ore, osservare la piastra al microscopio ottico per garantire la formazione di sferoidi.

3. Trattamento delle cellule tumorali del colon-retto 3D con LCFS

  1. Generare sferoidi come descritto nei passaggi 2 e 3.
  2. Prima di eseguire il trattamento LCFS, scongelare l'LCFS congelato a temperatura ambiente (RT) per 10 - 20 min.
  3. Inoculare la soluzione stock LCFS in un mezzo di crescita. Diluire in serie al 25%, 12,5% e 6% nel mezzo di crescita (cioè 25% LCFS = 150 μL di terreno di crescita + 50 μL di LCFS).
  4. Estrai la piastra di coltura cellulare contenente sferoidi dall'incubatore e rimuovi il più possibile il mezzo di crescita da ciascun pozzo usando una pipetta da 200 μL.
  5. Aggiungere il mezzo di crescita con LCFS sulle cellule e incubare a 37 °C in un incubatore CO2 al 5% per 24 - 48 ore.
    NOTA: il volume da utilizzare dipenderà dalla dimensione della piastra come segue: 2 ml per piastre di coltura cellulare a 6 pozzi; 200 μL per piastre di coltura cellulare a 96 pozzi.

4. Vitalità cellulare per sferoidi

  1. Preparare 8 - 10 sferoidi del cancro del colon-retto trattati con LCFS in piastre multi-pozzo a parete opaca (i saggi di vitalità cellulare vengono eseguiti 48 ore dopo il trattamento con LCFS).
  2. Scongelare il reagente di vitalità cellulare (vedi Tabella dei materiali)a 4 °C per la notte.
  3. Equilibrare il reagente di vitalità cellulare a temperatura ambiente prima dell'uso.
  4. Prima di eseguire il test, rimuovere il 50% dei mezzi di crescita dagli sferoidi.
  5. Aggiungere 100 μL di reagente di vitalità cellulare a ciascun pozzo.
    NOTA: il volume da utilizzare dipenderà dalla dimensione della piastra come segue: 100 μL per piastre di coltura cellulare a 96 pozzi.
  6. Mescolare vigorosamente il reagente per 5 minuti per promuovere la lisi cellulare.
  7. Incubare per 30 min – 2 h a 37 °C.
  8. Registrare la luminescenza.

5. Analisi quantitativa in tempo reale della reazione a catena della polimerasi per gli sferoidi

  1. Per ogni condizione, preparare 10 - 15 sferoidi in un tubo da 2 ml e centrifugare per 3 minuti a 400 x g.
  2. Scartare il surnatante e lavare gli sferoidi due volte in 1 mL di PBS 1x ghiacciato.
    NOTA: Evitare la centrifugazione, lasciare che gli sferoidi si depositino.
  3. Aspirare il più possibile il PBS 1x e isolare l'RNA utilizzando un kit disponibile in commercio.
  4. Sintetizzare cDNA da 1 μg di RNA utilizzando un kit disponibile in commercio secondo il protocollo del produttore.
  5. Preparare un mix principale per eseguire tutti i campioni in triplice copia (vedere Tabella 1 e Tabella 2).
  6. Eseguire l'amplificazione in un mix master di modelli da 20 μL in ogni piastra qPCR.
  7. Mescolare bene le reazioni e girare se necessario.
  8. Eseguire campioni secondo le raccomandazioni del produttore dello strumento (Tabella 3).

6. Western blotting da sferoidi

NOTA: Quando si raccolgono gli sferoidi, utilizzare una pipetta da 200 μL e tagliare l'estremità delle punte per evitare di disturbare la loro struttura.

  1. Per ogni condizione, preparare 30 - 40 sferoidi in un tubo da 2 ml.
  2. Posizionare il tubo sul ghiaccio e lasciare che gli sferoidi si depositino sul fondo del tubo da 2 ml.
  3. Scartare il surnatante e lavare gli sferoidi due volte in 1 mL di PBS ghiacciato 1x
    NOTA: Evitare la centrifugazione, lasciare che gli sferoidi si depositino.
  4. Aspirare il più possibile il PBS 1x e aggiungere il tampone RIPA con un cocktail inibitore della proteasi (10 sferoidi = 30 μL di tampone RIPA).
  5. Lisire le cellule tubando su e giù ed eseguire la sonicazione per 30 s con 30 s di riposo sul ghiaccio per 10 cicli.
  6. Centrifugare i laccio proteica a 15000 x g per 15 min a 4 °C.
  7. Determinare la concentrazione proteica per ogni lizzata cellulare.
  8. Prima del caricamento, far bollire ogni llisi cellulare in un tampone campione a 100 °C per 10 minuti.
  9. Caricare quantità uguali di proteine nei pozzi del gel SDS-PAGE ed eseguire il gel per 1 - 2 ore a 100 V.
  10. Trasferire la proteina dal gel alla membrana PVDF.
  11. Dopo il trasferimento, bloccare la membrana per 1 ora a temperatura ambiente utilizzando un tampone di blocco (5% di latte scremato + TBS con 0,05% di Tween-20).
  12. Incubare la membrana con 1:1.000 diluizioni di anticorpi primari(Tabella 4)in 1x TBST con tampone BSA al 5% a 4 °C durante la notte.
  13. Lavare la membrana tre volte con TBST, 15 minuti per ogni lavaggio.
  14. Incubare la membrana con 1:2.500 diluizioni di anticorpi secondari nel tampone bloccante a temperatura ambiente per 2 ore (vedi Tabella dei materiali).
  15. Lavare la membrana tre volte con TBST, 15 minuti per ogni lavaggio.
  16. Preparare la membrana per il rilevamento HRP con un substrato chemiluminescente.
  17. Acquisisci immagini chemiluminescenti.

7. Colorazione dello ioduro di propidio (PI) degli sferoidi

  1. Preparare 5-10 sferoidi come descritto nella fase 4.1 e posizionare gli sferoidi in un incubatore a 37 °C e 5% CO2.
  2. Diluire uno stock di 1 mg/mL di PI 1:100 in 1x PBS.
  3. Rimuovere il 50% del mezzo da ciascun pozzo della piastra a 96 pozzi.
  4. Aggiungere 100 μL della soluzione PI a ciascun pozzo e posizionare i pozzi in un incubatore a 37 °C e 5% CO2 per 10 - 15 min.
  5. Lavare la soluzione PI con 1x PBS.
  6. Aggiungi 200 μL di terreno di coltura e scatta un'immagine usando un microscopio a fluorescenza. Analizza l'intensità della fluorescenza usando l'immagine J per ottenere il conteggio di vitalità dello sferoide.

8. Analisi FACS degli sferoidi

  1. Generare sferoidi come descritto in precedenza.
  2. Per ogni condizione, preparare 30 - 40 sferoidi in un tubo FACS e centrifuga per 3 minuti a 400 x g e RT.
  3. Aspirare il surnatante e lavare gli sferoidi in 3 mL di 1x PBS, quindi centrifugare a 400 x g per 3 min a 4 °C.
  4. Aspirare il surnatante e aggiungere 200 μL di 0,25% di tripsina-EDTA, quindi incubare a RT per 2 -3 min.
    NOTA: il tempo di incubazione dipende dalla dimensione dello sferoide e dal tipo di cella.
  5. Aggiungere 1 mL di tampone FACS e dissociare delicatamente gli sferoidi utilizzando una pipetta da 200 μL.
  6. Centrifugare le cellule dissociate a 400 x g e 4 °C per 3 min.
    NOTA: buffer FACS = 1x PBS + 2,5% FBS, filtrato utilizzando un filtro superiore da 0,22 μm.
  7. Eliminare il surnatante e aggiungere il reagente 7-AAD/Annexin V (7AAD (5 μL), Annexin V (5 μL)/campione).
  8. Ruota delicatamente le cellule e incuba per 13 - 30 minuti a RT al buio.
  9. Aggiungere 500 μL di tampone FACS e filtrare le celle utilizzando provette di polistirene conico per rimuovere le celle aggregate.
  10. Centrifugare a 400 x g e 4 °C per 3 min.
  11. Aggiungere 500 μL di tampone legante Annexin V a ciascun tubo e sospendare.
  12. Analizzare utilizzando un citometro a flusso.

Risultati

Descriviamo il protocollo per ottenere sferoidi da diverse linee cellulari di cancro del colon-retto. L'integrazione con metilcellulosa è stata necessaria per generare sferoidi. Presentiamo anche un metodo di preparazione LCFS e presentiamo un modello per studiare la correlazione tra probiotici e cancro del colon-retto. I protocolli di formazione sferoide e di preparazione LCFS sono schematicamente illustrati in Figura 1A,B. Come mostrato nella Figura 2...

Discussione

Il microambiente tissutale, comprese le cellule vicine e la matrice extracellulare (ECM), è fondamentale per la generazione dei tessuti e cruciale nel controllo della crescita cellulare e dello sviluppo dei tessuti13. Tuttavia, le colture 2D presentano diversi svantaggi, come l'interruzione delle interazioni cellulari, nonché alterazioni nella morfologia cellulare, ambienti extracellulari e l'approccio della divisione14. I sistemi di coltura cellulare 3D sono stati rigoro...

Divulgazioni

Gli autori non hanno informazioni finanziarie rilevanti.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata supportata dalla "Istituzione di standard di misurazione per la chimica e le radiazioni", numero di sovvenzione KRISS-2020-GP2020-0003, e "Sviluppo di standard di misurazione e tecnologia per biomateriali e convergenza medica", numero di sovvenzione KRISS-2020-GP2020-0004 programmi, finanziati dal Korea Research Institute of Standards and Science. Questa ricerca è stata sostenuta anche dal Ministero della Scienza e delle TIC (MSIT), dalla National Research Foundation of Korea (NRF-2019M3A9F3065868), dal Ministero della Salute e del Welfare (MOHW), dal Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, HI20C0558), dal Ministero del Commercio, dell'Industria e dell'Energia (MOTIE) e dal Korea Evaluation Institute of Industrial Technology (KEIT, 20009350). ID ORCID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Ringraziamo Chang Woo Park per l'assistenza con gli esperimenti.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments

10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl		Biorad4561036Pkg of 10
Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific4311971100 covers
10x transfer bufferIntronIBS-BT031A1 L
10X Tris-Glycine (W/SDS)IntronIBS-BT0141 L
Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/CaseCorningSCT-200-C500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case
BD Difco Bacto AgarBD214010500 g
BD Difco Lactobacilli MRS BrothBDDF0881-17-5500 g
CellTiter-Glo 3D Cell viability assayPromegaG9681100μl/assay in 96-well plates
Complete Protease Inhibitor CocktailSigma-Aldrich11697498001vial of 20 tablets
Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1Corning21-040-CV500 mL
EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranesfisher ScientificIPVH0001026.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapCorning35223525/Pack, 500/Case
Fetal Bovine Serum, certified, US originThermo Fisher Scientific16000044500 mL
iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890Biorad170889025 x 20 µL rxns
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad17251215 x 1 mL
Lactobacillus fermentumKorean Collection for Type CulturesKCTC 3112
L-Cysteine hydrochloride monohydrateSigma-AldrichC6852-25G25 g
Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C)TCIM0185500 g
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mLApplied Biosystems434690620 plates
Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilizedMilliporeSLGS033SB250
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AADBiolegend640934100 tests
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122100 mL
Propidium IodideIntrogenP1304MP100 mg
RIPA Lysis and Extraction BufferThermo Fisher Scientific89901250 mL
RNeasy Mini Kit (250)Qiagen74106250
RPMI-1640Gibco11875-119500 mL
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Fisher Scientific25200056100 mL
Name of Materials/Equipment/SoftwareCompanyCatalog NumberComments/Description
anti - p-IκBα (B-9)Santa cruzesc-8404200 µg/mL
anti-BclxL (H-5)Santa cruzesc-8392200 µg/mL
anti-PARP 1 (C2-10)Santa cruzesc-5364350 µl ascites
anti-β-actin (C4)Santa cruzesc-47778200 µg/mL
BD FACSVerseBD BiosciencesSan Diego, CA, USA
Synergy HTX Multi-Mode Microplate ReaderBioTS1LFA
CO2 incubatorThermo fisherHERAcell 150i
Conical tube 15 mlSPL50015
Conical tube 50 mlSPL50050
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well PlateSigma-AldrichCLS7007
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well PlateSigma-AldrichCLS3471
Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, SterileCostar4870
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermofisherC10228
Countess II FL Automated Cell CounterinvitrogenAMQAF1000
EnSpire Multimode ReaderPerkin ElmerEnspire 2300
Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channelEppendorf3122000051
FlowJo softwareTreeStarAshland, OR, USA
Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson immunoresearch115-035-0621.5 mL
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson immunoresearch111-035-1442.0 mL
GraphPad Prism 5GraphPad SoftwareInc., San Diego, CA, USA
ImageJNIH
ImageQuant LAS 4000 miniFujifilmTokyo, Japan
Incubated shakerLab companionSIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0,FujifilmTokyo, Japan
Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis SpectrophotometersPerkin ElmerWaltham, MA, USA
Phase-contrast microscopeOlympusTokyo, Japan
SPL microcentrifuge tube 1.5mLSPL60015
SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, SterileSPL21012
StepOnePlus Real-Time PCR systemThermo Fisher ScientificWaltham, MA, USA
Vibra-Cell Ultrasonic Liquid ProcessorsSONICS-vibra cellVC 505500 Watt ultrasonic processor
Vinyl Anaerobic ChamberCOY LAB PRODUCTS

Riferimenti

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