Medição de edema cerebral pós-acidente vascular cerebral, zona de infarto e quebra da barreira hematoencefálica em um único conjunto de amostras cerebrais de roedores

Resumo

Este protocolo descreve uma nova técnica de medição dos três parâmetros mais importantes de lesão cerebral isquêmica no mesmo conjunto de amostras cerebrais de roedores. Usar apenas uma amostra cerebral é altamente vantajoso em termos de custos éticos e econômicos.

Resumo

Uma das causas mais comuns de morbidade e mortalidade em todo o mundo é o AVC isquêmico. Historicamente, um modelo animal usado para estimular o AVC isquêmico envolve o oclusão da artéria cerebral média (MCAO). A zona infarto, o edema cerebral e a quebra da barreira hematoencefálica (BBB) são medidos como parâmetros que refletem a extensão da lesão cerebral após o MCAO. Uma limitação significativa para este método é que essas medidas são normalmente obtidas em diferentes amostras cerebrais de ratos, levando a encargos éticos e financeiros devido ao grande número de ratos que precisam ser eutanizados para um tamanho amostral adequado. Aqui apresentamos um método para avaliar com precisão a lesão cerebral após mcao medindo zona de infarto, edema cerebral e permeabilidade BBB no mesmo conjunto de cérebros de ratos. Esta nova técnica fornece uma maneira mais eficiente de avaliar a fisiopatologia do AVC.

Introdução

Uma das causas mais comuns de morbidade e mortalidade em todo o mundo é o AVC. Globalmente, o AVC isquêmico representa 68% de todos os casos de AVC, enquanto nos Estados Unidos o AVC isquêmico é responsável por 87% dos casos de acidente vascular cerebral^1,2. Estima-se que o ônus econômico do AVC atinja US$ 34 bilhões nos Estados Unidos² e € 45 bilhões na União Europeia³. Modelos animais de AVC são necessários para estudar sua fisiopatologia, desenvolver novos métodos de avaliação e propor novas opções terapêuticas⁴.

O AVC isquêmico ocorre com a oclusão de uma artéria cerebral grave, geralmente a artéria cerebral média ou um de seus ramos⁵. Assim, os modelos de AVC isquêmico envolveram historicamente a oclusão da artéria cerebral média (MCAO)^{6,7,8,9,10,11,12}. Seguindo MCAO, a lesão neurológica é mais comumente avaliada pela medição da zona de infarto (IZ) usando um método de coloração de cloreto de tripheniltetrazolium (TTC) de 2,3,5, usando o método de coloração¹³, edema cerebral (BE) usando secagem ou cálculo dos volumes hemisféricos^14,15,16e permeabilidade da barreira cerebral sanguínea (BBB) por uma técnica de espectrometria usando a coloração azul evans^17,18,19.

O método tradicional de MCAO usa conjuntos separados de cérebros para cada uma das três medidas cerebrais. Para um grande tamanho amostral, isso resulta em um número significativo de animais eutanizados, com considerações éticas e financeiras adicionais. Um método alternativo para aliviar esses custos envolveria medições de todos os três parâmetros em um único conjunto de cérebros de roedores pós-MCAO.

Tentativas anteriores foram feitas para medir combinações de parâmetros na mesma amostra cerebral. Métodos simultâneos de coloração imunofluorescente^20, bem como outras análises moleculares e bioquímicas²¹ foram descritos após a coloração de TTC na mesma amostra cerebral. Calculamos anteriormente os volumes do hemisfério cerebral para avaliar o edema cerebral e realizamos a coloração do TTC para calcular a zona de infarto no mesmo conjunto cerebral¹⁵.

No presente protocolo, apresentamos uma técnica modificada de MCAO que mede a lesão cerebral isquêmica através da determinação da permeabilidade de IZ, BE e BBB no mesmo conjunto de cérebros de roedores. O IZ é medido pela coloração TTC, o BE é determinado pelo cálculo do volume hemisférico, e a permeabilidade do BBB é obtida pelos métodos de espectrometria¹⁹. Neste protocolo, utilizou-se um modelo MCAO modificado, baseado na inserção direta e fixação do cateter monofilamento na artéria carótida interna (ICA) e posterior bloqueio do fluxo sanguíneo para a artéria cerebral média (MCA)²². Este método modificado mostra uma taxa reduzida de mortalidade e morbidade em comparação com o método tradicional de MCAO^16,22.

Esta nova abordagem fornece um modelo financeiro e ético para medir lesões neurológicas após mcao. Essa avaliação dos principais parâmetros da lesão cerebral isquêmica ajudará a investigar de forma abrangente sua fisiopatologia.

Protocolo

Os seguintes procedimentos foram conduzidos de acordo com as recomendações da Declaração de Helsinque e Tóquio e as Diretrizes para o Uso de Animais Experimentais da Comunidade Europeia. Os experimentos também foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais da Universidade Ben-Gurion do Negev.

1. Preparando ratos para o procedimento experimental

1. Selecione ratos adultos machos Sprague-Dawley sem patologia atolizada, cada um pesando entre 300 e 350 g.
2. Mantenha todos os ratos à temperatura ambiente a 22 °C, com 12 horas de ciclos claros e escuros antes do experimento.
3. Certifique-se de que alimentos e água estão disponíveis ad libitum.
4. Realizar todos os procedimentos entre 6:00.m e 14:00.m.

2. Preparando ratos para cirurgia

1. Anestesiar os ratos por 30 minutos com isoflurane (4% para indução e 2% para manutenção) e 24% de oxigênio (1,5 L/min).
   1. Teste o nível de anestesia nos ratos, garantindo que eles não tenham um reflexo de retirada do pedal.
2. Insira o cateter de calibre 24 na veia da cauda.
   NOTA: O aquecimento da cauda para vasodilatação não é realizado.
   1. Coloque os ratos sobre a mesa em uma posição supina. Use fita médica para fixar todos os quatro membros dos ratos.
3. Coloque a sonda para medir a temperatura no reto do rato antes da cirurgia.
4. Durante o procedimento, mantenha uma placa de aquecimento para suportar uma temperatura corporal do núcleo de 37 °C.
5. Adicione pomada em ambos os olhos do rato para proteção.
6. Raspe a área cirúrgica e desinfete com três aplicações de 10% de povidone-iodo seguido de 70% de álcool isopropílico.

3. Oclusão da artéria cerebral do lado direito

NOTA: A MCAO é realizada por uma técnica modificada, conforme descrito anteriormente^16,22,23, com o uso de instrumentos descritos por McGarry et al.²⁴ e Uluç et al.²⁵.

1. Dissecar a pele e a fáscia superficial na linha média ventral do pescoço com pinças cirúrgicas e tesouras com lâminas curvas.
2. Identificar o triângulo muscular, composto pelo ICA, artéria carótida externa (ECA) e artéria carótida comum (CCA).
3. Separe cuidadosamente o CCA direito e o ICA do nervo vago com microforceps para cirurgia vascular.
4. Exponha a CCA direita e o ICA. Bloqueie o fluxo sanguíneo proveniente da CCA para o ICA usando micro-clipes ou torniquetes especiais para cirurgia vascular. Faça uma incisão (aproximadamente 1 mm) no ICA usando microscisores para cirurgia vascular.
5. Insira um cateter monofilamento (4-0 nylon) diretamente através do ICA, cerca de 18,5-19 mm do ponto de bifurcação da CCA direita no círculo de Willis até atingir uma leve resistência, para ocluir a MCA²⁶.
6. Ligate em torno do ICA acima da bifurcação da CCA.
7. Para o grupo de controle operado por farsa, realize uma inserção de linha de nylon em vez das etapas 3.5 e 3.6^16,22.
8. Administre 5 mL de cloreto de sódio de 0,9% por injeção intraperitoneal.
9. Feche a ferida por sutura e leve o rato para uma área de recuperação.
   NOTA: Alguns minutos após o fim da anestesia, o rato acordará e se moverá independentemente ao redor da gaiola.
10. Às 23 horas após mcao, injete 2% de Evans azul em soro fisiológico (4 mL/kg)^23,26 na veia traseira para ambos os grupos operados através de uma cânula²⁷.
    NOTA: Isto é usado como um rastreador de permeabilidade cérebro-sangue. Deixe circular por 60 minutos.

4. Determinação da zona de infarto

1. Medida IZ às 24h após MCAO como descrito anteriormente^{9,15,18,19,26}.
   NOTA: Ratos que perderam mais de 20% de seu peso ou desenvolveram convulsões ou hemiplegia são excluídos do experimento.
2. Eutanize o rato substituindo a mistura de gás inspirada por 20% de oxigênio e 80% de dióxido de carbono até que o rato deixe de respirar espontaneamente.
3. Abra o peito com uma incisão lateral de 5-6 cm através da parede abdominal sob a caixa torácica usando tesouras e fórceps cirúrgicos.
4. Realize uma incisão diafragmática ao longo de toda a extensão da caixa torácica com tesoura e fórceps cirúrgicos.
5. Deslocando cuidadosamente os pulmões, cortando a caixa torácica até a clavícula nos lados direito e esquerdo²⁸.
6. Perfuse com 200 mL de soro fisiológico normal através do ventrículo esquerdo do coração.
7. Puna ou incise o átrio direito do coração com uma tesoura.
8. Realizar decapitação usando uma guilhotina e coletar tecido cerebral.
9. Usando uma tesoura de íris, cortada do foie magnum até a borda distal da superfície posterior do crânio em ambos os lados.
10. Separe as lâmpadas olfativas, conexões nervosas ao longo da superfície ventral e superfície dorsal do crânio do cérebro.
11. Remova o cérebro da cabeça.
12. Produza 6 fatias cerebrais criando seções horizontais de 2 mm de espessura com uma lâmina de barbear de 0,009", sem revestimento, de borda única.
13. Incubar por 30 min a 37 °C em 0,05% TTC.
14. Coloque o tecido cerebral nos slides do microscópio e realize a varredura óptica dessas 6 fatias cerebrais com uma resolução de 1600x1600 dpi (ver Suplemento 1, por exemplo).
15. Adicione um filtro azul com um editor de fotos (por exemplo, Adobe Photoshop CS2) usando a função Channel Mixer(Image > Adjustments > Channel Mixer) e salve a imagem como um formato de arquivo JPEG.
    NOTA: Após a aplicação do filtro azul, a imagem aparecerá em escala de cinza.
16. Abra a imagem salva em ImageJ 1.37v^29,30.
    NOTA: Este programa de computador usa uma função limiar para isolar e calcular os pixels que são preto ou branco (ver Figura 1).
17. Para cada uma das 6 fatias cerebrais da imagem, selecione e salve cada hemisfério (ipsilateral direito ferido e contralateral inin ferido) como um arquivo de imagem separado usando a ferramenta "seleção de polígonos" do menu principal.
18. Defina o limite para determinar o IZ usando uma função de limiar automático do menu principal do software ImageJ selecionando Image > Adjust > Threshold, e meça o número de pixels em cada hemisfério de um único conjunto cerebral.
    NOTA: Macros podem ser usadas para esta etapa no software ImageJ (ver Suplemento 2 para o código). O corte é um parâmetro crítico para determinar quais pixels converter em branco e que se converter em preto dependendo do tom de cinza (ver Suplemento 3 e Suplemento 4 como exemplos). ImageJ então compara pixels brancos e pretos para determinar IZ. Com base no protocolo de coloração e configurações do scanner, usamos um valor de corte constante de 0,220.
19. Realizar a medição da correção do IZ para inchaço tecidual utilizando as Razões dos Hemisférios Cerebrais Ipsilaterais e Contralateral (RICH) método^13,23 (ver exemplo no Suplemento 5).
    
    NOTA: O tamanho do infarto é avaliado como uma porcentagem do hemisfério contralateral.

5. Determinação do edema cerebral³¹

NOTA: Use ImageJ 1.37v para medição de BE^32,33.

1. Meça BE 24 h após MCAO. Para cálculo do BE, utilize os dados do volume do hemisfério esquerdo e direito (em unidades).
2. Realize a digitalização óptica com uma resolução de 1600x1600 dpi (ver Suplemento 1, por exemplo).
3. Selecione hemisférios cerebrais e defina o corte para determinar BE com ImageJ 1.37v, conforme descrito acima nas seções 4.17-4.19.
4. Expresse a área BE como uma porcentagem das áreas padrão do hemisfério contralateral não afetado, calculada pelo método RICH utilizando a equação seguinte (ver exemplo no Suplemento 5)^23,34.
   
   NOTA: A extensão do BE é avaliada como uma porcentagem do hemisfério contralateral.

6. Determinação do rompimento do BBB

1. Medir o rompimento do BBB 24 h após MCAO.
2. Divida os hemisférios direito e esquerdo em seis fatias e coloque cada uma em um tubo de microcentrífuga.
3. Homogeneize cada fatia do tecido cerebral em ácido tricloroacético, com base no cálculo de 1 g de tecido cerebral em 4 mL de ácido tricloroacético de 50%.
4. Centrifugar a 10.000 x g por 20 min.
5. Líquido supernacido diluído 1:3 com 96% de etanol.
6. Realize a espectrofotometria de luminescência utilizando o software de espectrofotometria, instalando a placa e realizando uma leitura amostral usando os seguintes parâmetros: Comprimento de onda de intensidade de fluorescência de 620 nm (largura de banda 10 nm) e um comprimento de onda de emissão de 680 nm (largura de banda 10 nm)^23,35 ; Mod top; Número Carne 25; Manual 100; Tremendo 1 segundo, 1 mm.
   NOTA: Use um comprimento de onda de excitação de 620 nm (largura de banda 10 nm) e um comprimento de onda de emissão de 680 nm (largura de banda 10 nm). ^23,35

Resultados

Medição da zona de infarto

Um teste t de amostra independente indicou que 19 ratos submetidos a MCAO permanente demonstraram um aumento significativo no volume de infarto cerebral em comparação com os 16 ratos operados por vergonha (MCAO=7,49% ± 3,57 vs. Sham = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (ver Figura 2A).). Os dados são expressos como uma porcentagem média do hemisfério contralateral ± SD.

Discussão

O objetivo principal do presente protocolo foi demonstrar medições consistentes de três parâmetros principais de lesão isquêmica: permeabilidade IZ, BE e BBB. Estudos anteriores neste campo demonstraram a possibilidade de realizar um ou dois desses parâmetros juntos na mesma amostra. Além da redução de custos que este método de três partes oferece, ele também fornece um modelo bioético mais desejável que limita o número de animais que devem ser operados e, posteriormente, eutanizados. Como em todas as té...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Syringe	Braun	4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	Sigma-Aldrich	500 cc	Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe	Braun	305620
3-0 Silk sutures	Henry Schein	1007842
4-0 Nylon suture	4-00
Brain & Tissue Matrices	Sigma-Aldrich	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P	Sigma-Aldrich	Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances	Sigma-Aldrich	HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale	Sigma-Aldrich	Rs 4,000
Dissecting scissors	Sigma-Aldrich	Z265969
Eppendorf pipette	Sigma-Aldrich	Z683884
Eppendorf tube	Sigma-Aldrich	EP0030119460
Fluorescence detector	Tecan, Männedorf Switzerland	Model: Infinite 200 PRO multimode reader	Optional.
Fluorescence detector	Molecular Devices LLC	VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument	Optional.
Gauze sponges	Fisher	22-362-178
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips	Sigma-Aldrich
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Infusion cuff	ABN	IC-500
Micro forceps	Sigma-Aldrich
Micro scissors	Sigma-Aldrich
Multiset	Teva Medical	998702
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Operating forceps	Sigma-Aldrich
Operating scissors	Sigma-Aldrich
Optical scanner	Canon	Cano Scan 4200F	Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5606
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11	Sigma-Aldrich	S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows	Adobe
ImageJ 1.37v	NIH		The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
SPSS Statistics 22	IBM
Office 365 ProPlus	Microsoft	-	Microsoft Office Excel
Windows 10	Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	298-96-4
50% trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	76-03-9
Ethanol 96 %	Romical		Flammable liquid
Evans blue 2%	Sigma-Aldrich	314-13-6
Isoflurane, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017