JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Sığır yumurtalık korteksinin in vitro kültürü ve beslenme Merdiven adım diyetinin yumurtalık mikroçevrişi üzerindeki etkisi sunulmuştur. Yumurtalık korteks parçaları yedi gün boyunca kültürlendi ve steroidler, sitokinler ve folikül evreleri değerlendirildi. Merdiven-Adım diyet tedavisi, kültürde folikül ilerlemesine neden olan steroidogenezi artırmıştı.

Özet

İlkel evreden antral evreye kadar folikül gelişimi, yumurtalık korteksi içinde somatik hücrelerden ve kümülüs hücre-oosit iletişiminden endokrin ve parakrin faktörleri içeren dinamik bir süreçtir. Yumurtalık mikroçevrişi ve çevredeki milieu üretilen sitokinler ve steroidler folikül ilerlemesini veya tutuklanmasını nasıl etkilediği hakkında çok az şey bilinmektedir. Yumurtalık korteksinin in vitro kültürü, foliküllerin bitişik stroma tarafından desteklenen normalleştirilmiş bir ortamda gelişmesini sağlar. Amacımız, sığır yumurtalık korteksinin in vitro kültürü ile beslenme Merdiven-Adım diyetinin yumurtalık mikroçevrişi (folikül gelişimi, steroid ve sitokin üretimi) üzerindeki etkisini belirlemekti. Bunu başarmak için, yumurtalık kortikal parçaları ergenlikten önce iki farklı besinsel olarak geliştirilmiş şemadan geçen düvelerden çıkarıldı: Kontrol (geleneksel beslenme gelişimi) ve Yaklaşık 0.5-1 mm3 parçaya kesilen Merdiven-Adım (gelişim sırasında beslenme ve kısıtlama). Bu parçalar daha sonra bir dizi yıkamadan geçirildi ve Waymouth'un kültür ortamını içeren bir kuyuya yerleştirilmiş bir doku kültürü kesici ucuna yerleştirildi. Yumurtalık korteksi günlük kültür medya değişiklikleri ile 7 gün boyunca kültürlendi. Ek tedavi olmaksızın beslenmenin etkilerini ve kültürün etkisini belirlemek için kültür öncesi ve sonrası folikül evre değişikliklerini belirlemek için histolojik kesitleme yapıldı. Korteks kültür ortamı steroidler, steroid metabolitler ve sitokinleri ölçmek için günlerce birikti. Yumurtalık mikroçevriminde artan steroid hormonları için eğilimler vardı, bu da Merdiven-Adım ve Kontrol yumurtalık korteks kültürlerinde folikül ilerlemesine izin sağladı. Yumurtalık korteks kültürü tekniği, yumurtalık mikroçevrinin daha iyi anlaşılmasını ve endokrin salgıdaki değişikliklerin hem in vivo hem de in vitro tedavilerden folikül ilerlemesini ve büyümesini nasıl etkileyebileceğini sağlar. Bu kültür yöntemi, doğurganlığı teşvik etmek için kadınlarda folikül ilerlemesini artırabilecek potansiyel terapötiklerin test edilmesi için de yararlı olabilir.

Giriş

Yumurtalık korteksi, folikül gelişiminin meydana geldiği yumurtalığın dış tabakasını temsil eder1. Başlangıçta geliştirme aşamasında tutuklanan ilkel foliküller, parakrin ve gonadotropin girişlerine dayanan birincil, ikincil ve daha sonra antral veya üçüncül foliküllerhalinegelecek şekilde etkinleştirilecektir 1,2,3,4. Yumurtalık içindeki fizyolojik süreçleri daha iyi anlamak için doku kültürü in vitro model olarak kullanılabilir, böylece kontrollü bir ortamın deneyler yapmasına izin verir. Birçok çalışma, yardımcı üreme teknolojisi, doğurganlık koruma ve yumurtalık kanseri5,6,7araştırmalarında yumurtalık doku kültürünü kullanmıştır. Yumurtalık doku kültürü, yumurtalık sağlığına ve Polikistik Over Sendromu (PKOS) 8,9,10,11gibi üreme bozukluklarının etiyolojisine zarar veren üreme toksinlerinin araştırılması için de bir model görevi görmüştür. Bu nedenle, bu kültür sistemi çok çeşitli uzmanlıklar için geçerlidir.

Kemirgenlerde, üreme biyolojisi deneylerinde tüm fetal veya perinatal gonadlar kullanılmıştır12,13,14,15. Bununla birlikte, daha büyük evcil hayvancılıktan gelen gonadlar, büyük boyutları ve potansiyel dejenerasyonları nedeniyle tüm organlar olarak kültürlenemez. Bu nedenle, sığır ve insan olmayan primat yumurtalık korteksi daha küçük parçalar halinde kesilir16,17,18. Birçok çalışma, evcil hayvancılıkta ve insan dışı primatlarda ilkel folikül başlatmada çeşitli büyüme faktörlerini (leri) incelemek için küçük yumurtalık korteks parçalarını kültüre 1,17,18,19. Yumurtalık korteks kültürünün kullanımı, 7 gün boyunca kültürlenen sığır ve primat kortikal parçalar için serum yokluğunda ilkel folikül inisiyonu göstermiştir20. Yang ve Fortune 2006 yılında fetal yumurtalık korteks kültür ortamını 10 gün boyunca bir dizi testosteron dozu ile tedavi etti ve testosteronun 10-7 M konsantrasyonunun folikül alımını, sağkalımını ve erken evre foliküllerin ilerlemesini artırdığını gözlemledi19. 2007 yılında, sığır fetüslerinden (5-8 aylık gebelik) yumurtalık korteks kültürlerini kullanan Yang ve Fortune, birincil ila ikincil folikül geçişinde Vasküler Endotel Büyüme Faktörü A (VEGFA) için bir rol bildirmektedir21. Ayrıca laboratuvarımız, VEGFA izoformlarının (anjiyojenik, antianjiyojenik ve bir kombinasyon) VEGFA'nın16'yabağladığı ana sinyal transdüksiyon reseptörü olan Kinaz etki alanı reseptörü (KDR) aracılığıyla farklı sinyal transdüksiyon yollarını nasıl düzenleyebileceğini göstermek için yumurtalık korteks kültürlerini kullanmıştır. Bu bilgiler, farklı VEGFA izoformlarının folikül ilerlemesini veya tutuklanmasını ortaya çıkarmak için sinyal yollarını nasıl etkilediğinin daha iyi anlaşılmasını sağladı. Birlikte ele alındığında, yumurtalık korteks parçalarının farklı steroidler veya büyüme faktörleri ile in vitro kültüring folikülogenezi düzenleyen mekanizmalar üzerindeki etkilerini belirlemek için değerli bir tahlil olabilir. Benzer şekilde, farklı beslenme rejimleri üzerinde geliştirilen hayvanlar, kadın üreme olgunluğunu etkileyen folikülogenezleri teşvik edebilecek veya inhibe edebilecek yumurtalık mikroçevranlıklarını değiştirmiş olabilir. Bu nedenle, mevcut elyazmasındaki amacımız sığır korteksi kültür tekniğini bildirmek ve daha önce açıklandığı gibi 13 aylıkken toplanan Kontrol veya Merdiven-Adım diyetlerinden beslenen düvelerden sığır korteksinin in vitro kültüründen sonra yumurtalık mikroçevrimlerinde farklılıklar olup olmadığınıbelirlemektir 16.

Bu nedenle, bir sonraki adımımız farklı beslenme diyetleri ile geliştirilen bu düvelerdeki yumurtalık mikroçevrini belirlemekti. Merdiven-Adım veya Kontrol diyeti ile beslenen düvelerden yumurtalık korteksini değerlendirdik. Kontrol düvelerine 84 gün boyunca 97,9 g/kg0,75 bakım diyeti önerildi. Merdiven-Adım diyeti, 84 gün boyunca 67.4 g / kg0.75 kısıtlı bir beslenme diyeti içeren 8 ayda başlatıldı. İlk 84 günden sonra, Control düveleri 97.9 g/kg0.75almaya devam ederken, Merdiven-Basamak sığır düvelerine 68 gün daha118.9 g/kg 0.75 teklif edildi, daha sonra kültür öncesi ve sonrası foliküler evrelerde ve morfolojide yapılan değişiklikleri inceledikleri için13 aylıkken ovaerektomi yapıldılar. Biz de steroidler, steroid metabolitler, kemokinler ve korteks medya içine salgılanan sitokinler farklılıklar için test. Steroidler ve diğer metabolitler, in vivo ve/veya in vitro olarak yapılan tedavilerden doku canlılığı ve üretkenliği üzerinde doğrudan bir etki olup olmadığını belirlemek için ölçüldü. Kültürden önce ve sonra yumurtalık mikroçevrinde meydana gelen değişiklikler, kültürden önce endokrin milieu ve folikülogenezin bir anlık görüntüsünü ve kültür sırasında kültür veya tedavinin folikül ilerlemesini veya tutuklanmasını nasıl etkilediğini sağladı.

Yumurtalıklar,16yaşında 13 aylık Kontrol ve Merdiven-Basamak düvelerinden IACUC prosedürlerine göre ABD Et Hayvanları Araştırma Merkezi'nde (USMARC) yumurtalıklar yapıldıktan sonra toplandı , kan ve diğer kirleticileri çıkarmak için steril fosfat tampon salin (PBS) ile% 0.1 antibiyotikle temizlendi, fazla doku kesilmiş ve 37°C23'te Nebraska-Lincoln Üniversitesi (UNL) Üreme Fizyolojisi laboratuvarı UNL'ye nakledildi. . UNL'de yumurtalık korteks parçaları küçük kare parçalar halinde kesildi (~0.5-1 mm3; Şekil 1) ve 7 gün kültürlü (Şekil 2). Histoloji, folikül evreleri16,24 (Şekil 3 ve Şekil4 ) ve fibrozis gösterebilecek hücre dışı matris proteinlerini belirlemek için kültürden önce ve sonra korteks kültürü slaytları üzerinde yürütülmüştür (Picro-Sirus Red, PSR; Şekil 5). Bu, in vivo beslenme rejimlerinin folikül evreleri üzerindeki etkisinin belirlenmesine izin verdi ve folikül evreleri ve folikül ilerlemesi üzerinde 7 günlük yumurtalık korteksinin karşılaştırılmasına izin verdi. Kültür boyunca, ortam günlük olarak toplandı ve değiştirildi (her gün medyanın yaklaşık% 70'i toplandı; 250 μL / kuyu) böylece günlük hormonlar / sitokinler / kemokinler günlük olarak değerlendirilebilir veya ortalama konsantrasyonlar elde etmek için gün içinde birikebilir. Androstenedione (A4) ve östrojen (E2) gibi steroidler 3 gün boyunca birikebilir ve radyoimmunoassay (RIA; Şekil 6) ve hayvan başına 4 günden fazla havuzlanmış ve Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (HPLC-MS)24,25 (Tablo 1)ile test edilir. Sitokin dizileri yumurtalık korteks kültürüortamında sitokin ve kemokin konsantrasyonlarını değerlendirmek için kullanılmıştır (Tablo 2). Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) test plakaları, daha önce gösterildiği gibi belirli sinyal iletim yolları için gen ekspresyonlarını belirlemek için yapılmıştır16. Tüm steroid, sitokin, folikül evresi ve histolojik belirteçler yumurtalık mikroçevroronment bir anlık sağlar ve bu mikroçevrenim "normal" veya "anormal" folikülogenez teşvik yeteneği hakkında ipuçları.

Protokol

Yumurtalıklar ABD Et Hayvanları Araştırma Merkezi16.'dan alınmıştır. Daha önce belirtildiği gibi16, tüm prosedürler ABD Et Hayvanları Araştırma Merkezi (USMARC) Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından Tarımsal Hayvanların Tarımsal Araştırma ve Öğretimde Bakımı ve Kullanımı kılavuzuna uygun olarak onaylanmıştır. Yumurtalıklar, işlendikleri ve kültürlendikleri Nebraska-Lincoln Üniversitesi Üreme Laboratuvarı'na getirildi.

1. Gerekli ortamın hazırlanması

  1. Waymouth MB 752/1 orta
    1. 1 L doku kültürü şişesi 900 mL steril su ile doldurun. Su bir karıştırma plakası üzerinde hafifçe karıştırırken, yavaş yavaş toz ortamı ekleyin. Toz ortam çözüldükten sonra, 2,24 g sodyum bikarbonat ve ardından 1,25 g sığır serumu albümini (BSA) ekleyin. Bir pH ölçer kullanın ve pH'ı 7,25-7,35 olarak ayarlayın. Son hacmi 1 L'ye çıkarmak için ek steril su ekleyin.
    2. Biyolojik bir güvenlik kabinine geçin ve ortamın% 0.1 v / v konsantrasyonda penisilin-streptomisin sülfat ekleyin. Ortamı 0,22 μm gözenekli 33,2 cm2 500 mL şişe üst filtresi ile filtreleyin.
    3. Filtrelenmiş ortamı birkaç 50 mL konik tüpe dökün. 50 mL aliquoted ortam başına 0,5 mL İnsülin-Transferrin-Selenyum ekleyin.
    4. Konik tüpleri ve ortamın stok şişesini alüminyum folyoya sarın ve 4 °C'de saklayın. Bu ortam ışığa duyarlıdır.
      NOT: Waymouth ortamı 1 aya kadar saklanabilir.
  2. Leibovitz'in L-15 (LB-15) ortamı
    NOT: LB-15 ortamı kültüre hazırlık için dokuyu temizlemek için kullanılır.
    1. 1 L doku kültürü şişesi 900 mL steril su ile doldurun. Steril su bir karıştırma plakası üzerinde hafifçe karıştırılırken, hazırlanan toz ortamı yavaş yavaş ekleyin. Bir pH ölçer kullanın ve pH'ı 7,25-7,35 olarak ayarlayın. Son hacmi 1 L'ye çıkarmak için ek steril su ekleyin.
    2. Biyolojik güvenlik kabinine geçin. %0,1 antibiyotik ile 1 L LB-15 yapın (bkz. Malzeme Tablosu). Ortamı 0,22 μm gözenek 33,2cm 2 500 mL şişe üst filtresi kullanarak iki adet 500 mL doku kültürü şişesine filtreleyin. LB-15 ortamı ışığa duyarlı olduğu için şişeleri alüminyum folyoya sarın ve 4 °C'de saklayın.
      NOT: LB-15 ortamı 1 aya kadar saklanabilir.
  3. Fosfat Tamponlu Tuzlu (PBS)
    1. Laboratuvarda PBS yapın veya kalsiyum veya magnezyum olmadan steril PBS satın alın(Malzeme Masası). Laboratuvarda PBS yapmak için, 800 mL damıtılmış su ile başlayın ve içine 8 g sodyum klorür (NaCl) ekleyin. Ardından, 0,2 g potasyum klorür (KCl), 1,44 g sodyum fosfat dibasik (Na2HPO4)ve 0,24 g potasyum fosfat dibasik (KH2PO4)ekleyin. pH'ı ~7,4 olarak ayarlayın ve toplam hacmi 1 L'ye ayarlayın.
    2. Biyolojik güvenlik kabinindeyken % 0,1 antibiyotikle 1 L PBS yapın (bkz. Malzeme Tablosu).

2. Yumurtalık kortikal kültür protokolü

NOT: Yumurtalıklar 13 aylıkken ilkbaharda doğan USMARC düvelerinden elde edilmiştir. Yumurtalıklar iyice durulandı ve tüm kan ve diğer sıvılar antibiyotik içeren PBS (%0.1) ile çıkarıldı ve 37 °C23'te Nebraska-Lincoln Üniversitesi Üreme Laboratuvarı UNL'ye (1.5 saat uzaklıkta) taşındı. (Taşıma sırasında yumurtalıkların sıcaklığı hakkında yorum için lütfen Tartışma'yabakın)

  1. Yumurtalık dokusunu temiz bir tezgahta hazırlayın (Şekil 1).
    1. Temiz bankı% 70 etanol ile dezenfekte edin. Tezgah üstüne taze emici bir ped yerleştirin. Emici ped de dahil olmak üzere temiz tezgahtaki herhangi bir şeyi sterilize etmek ve uygun KKD'nin kullanıldığından emin olmak için temiz tezgah üfleyicinin diseksiyondan yarım saat önce UV ışığı ile birlikte açıldığından emin olun.
    2. Petri tabaklarını (60 x 15 mm) doku yıkamaları için düzenleyin. PBS yıkama için üç Petri kabı, antibiyotikli PBS için üç ve LB-15 yıkamalar için üç Petri kabı gereklidir. Yıkamadan sonra parçaların son yerleşimi için ek bir LB-15 içeren petri kabı ve beraberindeki kapak kullanılacaktır.
    3. Her Petri kabına PBS veya LB-15 olmak üzere yaklaşık 10 mL uygun sıvı doldurun.

figure-protocol-4448
Şekil 1:Yumurtalıkve korteks parçalarının temiz tezgahta yıkanması için plakaların düzeni. (A) Korteksin bölümleri olarak yumurtalığın yıkanmasında kullanılan PBS çıkarılır. (B) KORTEKs parçalarının taşındığını antibiyotikli yıkamalar ile PBS. (C) Yumurtalık korteks parçaları LB-15'te son yıkama için biyogüvenlik kabinine geçmeden önce LB-15'te dört kez yıkanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

  1. Hazırlanan Waymouth ve LB-15 ortamını buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığına ısıtın.
  2. Kullanmadan önce sterilizasyonu sağlamak için tüm araçları otoklavlayın.
  3. Yumurtalık korteksi toplanmaya hazır olana kadar yumurtalıkları 37 °C'de koruyun.
  4. Tırtıklı çeneli tokalar kullanarak yumurtalığı alın ve ilk PBS dolu Petri kabında iyice yıkayın. Yumurtalığı ikinci PBS yıkamaya aktarın ve bir kez daha iyice temizleyin.
    NOT: Yumurtalık kortikal şeritler çıkarılırken yumurtalık ikinci PBS yıkamada kalacaktır.
  5. Tırtıklı çene toksları kullanarak yumurtalığı sabitleyin ve ikiye bölün. Şu anda, yumurtalık korteksi medulladan kesilecektir. Bir cetvel kullanarak, yumurtalık yüzeyinin en fazla 1-2 mm derinliğinin medulla16'danuzaklaştırıldığından emin olun. Yumurtalık korteksinin enine bölümlerini medulladan çıkarın, 3-4 ince yumurtalık korteksi şeridini (Şekil 2) neşterle (#11 neşter bıçağı; #3 tutamak) kesin ve şeritleri üçüncü PBS dolu Petri kabına yerleştirin.
    NOT: Şu anda, RNA ekstraksiyonu için ek yumurtalık kortikal dokusu toplanabilir veya kültürsüz ilk korteks parçalarının histolojisi için sabitlenebilir ve toplanabilir. Yumurtalık korteks şeritlerini çıkarırken, görünür antral foliküller veya corpora lutea içeren alanlardan kaçının. Ek olarak, medüller doku toplamaktan kaçının. Medulla histolojisi daha önce gösterildiği gibi çok farklıdır16. Yumurtalık korteksi 1-2 mm'den fazla derinliğe kesilmezse, medulla elde edilmelidir. Farklı histoloji korteks ve medulla arasındaki yer işaretlerine izin verir.
  6. Üçüncü PBS yıkamadaki yumurtalık korteks şeritlerini 21 numaralı neşter bıçağıyla küçük, kare parçalara(~0,5–1 mm 3)kesin. Tutarlı yumurtalık korteks parçaları yapmak için parçaların benzer boyut ve kalınlıklarda olduğundan emin olmak için Petri tabaklarının altında bir cetvel kullanın. Parçaları neşterle keserken şeritleri sabitlemek için önseçim kullanın.
    NOT: Kesilen doku parçalarının sayısı deneye bağlıdır. Dört parça yumurtalık korteksi kültür için gerekli minimum doku miktarıdır. Uygun uzunluk ve derinliği sağlamak için diğer yöntemler arasında şablon olarak özel dilimleyiciler26 veya önceden kesilmiş plastik parçaların kullanılması27.
  7. Yumurtalık kortikal parçalarını antibiyotik dolu Petri kapları ile üç PBS'de de yıkayın. Parçaları yıkamalar arasında taşımak için kavisli bir uçlu toka kullanın.
  8. Korteks parçalarını LB-15 yıkama serisinde hareket ettirin ve son LB-15 dolu Petri kabına yerleştirin. Kapağı hayvan kimliği ve yumurtalık tarafı (sol veya sağ) ile etiketleyin.
    NOT: Kapsamlı temizlik için yumurtalık korteks parçalarını her yıkamaya tamamen batırın.
  9. Yumurtalık başına dört yumurtalık korteks parçası toplayın ve sıfırıncı gün histolojisi için sabitleyin. Ek parçalar da RNA için flaş dondurulabilir. Kalan doku parçaları kültür için kullanılacaktır. Her doku toplama işleminden sonra kesme aletlerini % 70 etanol ile silin.
  10. Son doku yıkama ve kültür hazırlığı için biyolojik bir güvenlik kabini hazırlayın. Biyolojik güvenlik kabinine yerleştirmeden önce malzemeleri% 70 etanol ile sterilize edin. Biyolojik güvenlik kabininde çalışırken aseptik tekniği kullanın.
  11. Kültüre yönelik tüm yumurtalık korteksini biyolojik güvenlik kabinine taşıyın ve LB-15 dolu petri kabında bir kez daha yıkayın.
  12. 24 kuyulu doku kültürü plakasında pipet kuyu başına 350 μL Waymouth orta.
  13. Kaplamasız kültürü, kümes uçlarını kullanarak her kuyuya iyi ekler yerleştirin. Dokunun kurumasını sağlayacağından kesici ucun tabanının altında kabarcık oluşmamasını sağlayın. Ortamın emilmesini ve yumurtalık korteks parçalarını çevrelemesi için ortamın kesici uçlara dokunması gerekir.
  14. Dört yumurtalık korteks parçasını her kesici ucun örgüsüne dikkatlice yerleştirin (Şekil 2). Doku parçaları hassas bir şekilde yerleştirilmezse, kümesler ağı delebilir. Doku parçaları birbirine veya kesici ucun yanına değmemelidir.
  15. Dokuyu % 5 CO216ile 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Diğerleri 38.8 °C28kullanmıştır. Bununla birlikte, dokunun bütünlüğünde veya foliküllerin 37 °C dokuda ilerleme yeteneğinde veya diğerlerinde39,30. Bu nedenle, bu noktada bu sıcaklıklardan herhangi biri başarıyı denemek için elverişli olmalıdır. Diğerleri 400 μL orta kullandı. Her iki miktar da tutarlı olduğu sürece iyidir ve doku kısmen batırılır ve yeterli yüzey geriliminin dokunun nemlendirilmesine izin vermesine izin verir (yumurtalık korteks parçalarını çevreleyen ortam). Diğer kuyulardan buharlaşmayı azaltmaya yardımcı olmak için boş kuyuları 500 μL steril su ile doldurun.

figure-protocol-10239
Şekil 2: Yumurtalık korteks parçaları ve kültür plakası. (A) Yumurtalığın korteksinden kesilen bir yumurtalık şeridi. (B) Cetvel ve korteks parçası yan yana gösterilmiştir. (C) Plakadaki kültür ortamında kesici ucun üzerinde dinlenmiş dört korteks parçası(~0,5-1 mm 3). (D) Kültür ortamını kuyudan toplamak için kesici ucun kaldırılması. Uygun pH'ı korumak için tüm kültür ortamını günlük (250 μL) toplayın ve değiştirin.Her kuyudan her gün yaklaşık 250 μL elde edilir (ilk kültür ortamının yaklaşık% 70'i). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Medya koleksiyonu

  1. Yumurtalık korteks kültürünü 7 gün boyunca her gün orta olarak değiştirin. Orta değişiklikler, ortadaki büyük pH ve renk değişikliklerini önlemek için mümkün olduğunca 24 saate yakın olmalıdır. Orta değişimden önce Sıcak Waymouth orta ila 37 °C. Her kuyudan her gün yaklaşık 250 μL elde edilir (ilk kültür ortamının yaklaşık% 70'i).
  2. Orta değişiklikler sırasında, kesici ucu kuyudan hafifçe çıkarmak için uzun uçları kullanın. Kültürlü Waymouth ortamını 0,5 mL tüplerde (yaklaşık 250 μL / gün) toplayın. Kesici ucu iyi bir şekilde yerleştirin ve ortamı kesici ucun yan tarafı ile kuyu arasına dağıtarak 350 μL taze kültür ortamı ekleyin.
    NOT: Yumurtalık mikroçevrimini belirlemek için gerekli tüm steroidleri, sitokinleri ve kemokinleri ölçmek için yeterli medya elde etmek için medyanın çoğunu günlük olarak değiştirin. Ayrıca, günlük orta değişiklikler, ortamdaki büyük pH değişikliklerini (renk değişimi ile gösterilir) önlemek için önemlidir. Parçaların ıslak kalmasını sağlamak için yumurtalık korteks parçalarını çevreleyen orta damlalar tutuldu. Ortamın %70'inin değişmesi nedeniyle kültürlü dokuda herhangi bir sorun gözlenmedi.
  3. Toplanan ortamı doku kültüründen -20 °C'de saklayın.

4. Görüntüleme ve aşağı akış işleme

  1. 37 °C'de % 5 CO2ile 7 günlük kültürden sonra, yumurtalık korteks parçalarını ekli bir kamera ve bir bilgisayar görüntüleme yazılımı programı ile diseksiyon mikroskobu kullanarak görüntüleyin.
    NOT: Karanlık bir oda genellikle görüntüleme için en iyi görüntü kalitesini elde etmek için en iyisidir.
  2. Görüntülemeden sonra, histoloji için Bouins'te kuyu başına iki yumurtalık korteks parçasını sabitleyin ve cDNA için RNA elde etmek için sıvı nitrojende iki yumurtalık korteksi parçasını flaş dondurun. Doku ile tüm kuyular için bu adımı tekrarlayın. Ortamı 7 günden itibaren toplayın ve -20 °C'de saklayın.
  3. Yumurtalık korteks parçalarının bouins'e (picrik asit 750 mL, buzul asetik asit 50 mL ve% 37-% 40 formalin 250 mL) üç kez% 70 etanol ile yıkanmadan önce yaklaşık 1,5 saat boyunca daldırmalarına izin verin. Doku% 70 etanolde kalacak ve çözelti artık sarı olmayana kadar günlük olarak temizlenecektir.
    NOT: Bouins dışındaki fiksatifler ve paraformaldehit kullanılabilir. Bu deneyimde Bouins, optimal morfolojiyi elde etmek için fiksatif olduğu için kullanılır. Diğer analizler için daha fazla doku gerekiyorsa, her hayvandan ek medya kuyuları ve yumurtalık korteks parçaları elde edilebilir.

Sonuçlar

Bu sığır korteksi kültürü prosedürü, yumurtalığın küçük parçalarından çok çeşitli hormon, sitokin ve histoloji verilerini belirlemek için kullanılabilir. Hematoksilin ve eozin (H&E) gibi boyama, folikül evreleme yoluyla yumurtalık morfolojisini belirlemek için kullanılabilir16,23,31 (Şekil 3). Kısaca, foliküller, granüloza öncesi hücrelerin tek bir tabakası ile çevri...

Tartışmalar

Bu yazıda açıklandığı gibi in vitro over korteks kültürünün faydası, foliküllerin folikülleri çevreleyen bitişik stroma ile normalleştirilmiş bir ortamda gelişmesidir. Somatik hücreler ve oosit bozulmadan kalır ve in vivo model olarak uygun hücreden hücreye iletişim vardır. Laboratuvarımız, 7 günlük bir kültür sisteminin yumurtalık korteksinin tedavisi için temsili folikülogenez ve steroidogenez verileri sağladığını tespit etti. Diğer yumurtalık doku kültürü protokolleri ya nisp...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu araştırma, Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü 2013-67015-20965 tarafından ASC'ye, Nebraska Gıda Gıda Üniversitesi ASC'ye Rekabetçi Hibeler için desteklendi. Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı Hatch, ASC'ye NEB26-202/W3112 Katılım #1011127, Hatch-NEB ANHL Katılım #1002234 ASC'ye hibe. Nicel Yaşam Bilimleri Girişimi Yaz Doktora Sonrası Akademik Destek – CMS için yaz finansmanı için COVID-19 Ödülü.

Yazarlar, daha sonra mevcut makalede bu tekniğin doğruluğunda bir kavram kanıtı olarak kullanılan önceki bir yayında yumurtalıkları sağladığı için dr. Robert Cushman, ABD Et Hayvanları Araştırma Merkezi, Clay Center, NE'ye teşekkür etmek istiyor.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
#11 Scapel BladeSwann-Morton 303Scaple Blade
#21 Scapel BladeSwann-Morton 307Scaple Blade
500mL Bottle Top FilterCorning430514Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium
AbsoluteIDQ Sterol17 AssayBiocratesSterol17 KitSamples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned 
Androstenedione Double Antibody RIA KitMPBio7109202RIA to determine androstenedione from culture medium
Belgium A4 Assay Kit DIA Source KIP0451RIA to determine androstenedione from culture medium
Bovine Cytokine Array Q3RayBiotechQAB-CYT-3-1Cytokine kit to determine cytokines from culture medium
cellSens Software Standard 1.3Olympus7790Imaging Software
Insulin-Transferrin-Selenium-XGibco ThermoFisher Scientific5150056Addative to the culture medium
Leibovitz's L-15 MediumGibco ThermoFisher Scientific4130039Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet 
Microscope OlympusSZX16Disection microscope used for imaging tissue culture pieces 
Microscope Camera OlympusDP71Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces 
Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm DiameterMillipore SigmaPICM01250Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it
Multiwell 24 well plateFalcon353047Plate used to hold meduim, inserts, and tissues
Petri dish 60 x 15 mmFalcon351007Petri dish used for washing steps prior to culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X)Corning21-040-CVUsed for tissue washing
SAS Version 9.3SAS Institute 9.3 TS1M2Statistical analysis software 
Thomas Stadie-Riggs Tissue SlicerThomas Scientific6727C10Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue
Waymouth MB 752/1 MediumSigma-AldrichW1625Medium used for tissue cultures

Referanslar

  1. Braw-Tal, R., Yossefi, S. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle growth in the bovine ovary. Journal of Reproduction and Fertility. 109, 165-171 (1997).
  2. Nilsson anEdson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
  3. Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. 163, 53-60 (2000).
  4. Ireland, J. J. Control of follicular growth and development. Journal of Reproduction and Fertility. 34, 39-54 (1987).
  5. Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
  6. Ramezani, M., Salehnia, M., Jafarabadi, M. Short term culture of vitrified human ovarian cortical tissue to assess the cryopreservation outcome: molecular and morphological analysis. Journal of Reproduction & Infertility. 18 (1), 162-171 (2017).
  7. McLaughlin, M., Telfer, E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
  8. Stefansdottir, A., Fowler, P. A., Powles-Glover, N., Anderson, R. A., Spears, N. Use of ovary culture techniques in reproductive toxicology. Reproductive Toxicology. 49, 117-135 (2014).
  9. Bromfield, J. J., Sheldon, I. M. Lipopolysaccharide reduces the primordial follicle pool in the bovine ovarian cortex ex vivo and in the murine ovary in vivo. Biology of Reproduction. 88 (4), 1-9 (2013).
  10. Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Humane Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
  11. Desmeules, P., Devine, P. J. Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries. Toxicological Sciences. 90 (2), 500-509 (2006).
  12. Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biology of Reproduction. 75, 56-67 (2006).
  13. Baltes-Breitwisch, M. M., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms or administration of proangiogenic isoforms stimulates vascular development in the rat testis. Reproduction. 140 (2), 319-329 (2010).
  14. McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biology of Reproduction. 81, 966-977 (2009).
  15. Artac, R. A., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms is more effective than treatment with proangiogenic isoforms in stimulating vascular development and follicle progression in the perinatal rat ovary. Biology of Reproduction. 81, 978-988 (2009).
  16. Abedal-Majed, M. A., et al. Vascular endothelial growth factor A isoforms modulate follicle development in peripbertal heifers independent of diet through diverse signal transduction pathways. Biology of Reproduction. 102 (3), 680-692 (2020).
  17. Wandji, S. A., Srsen, V., Voss, A. K., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation in vitro of bovine primordial follicles. Biology of Reproduction. 55, 942-948 (1996).
  18. Wandji, S. A., Srsen, V., Nathanielsz, P. W., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation of growth of baboon primordial follicles in vitro. Human Reproduction. 12 (9), 1993-2001 (1993).
  19. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Testosterone stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Biology of Reproduction. 75, 924-932 (2006).
  20. Fortune, J. E., Kito, S., Wandji, S. A., Srsen, V. Activation of bovine and baboon primordial follicles in vitro. Theriogenology. 49, 441-449 (1998).
  21. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Vascular endothelial growth factor stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Molecular Reproduction and Development. 74, 1095-1104 (2007).
  22. Barberino, R. S., Silva, J. R. V., Figueiredo, J. R., Matos, M. H. T. Transport of domestic and wild animal ovaries: a review of the effects of medium, temperature, and periods of storage on follicular viability. Biopreservation and Biobanking. 17 (1), 84-90 (2019).
  23. Summers, A. F., et al. Altered theca and cumulus oocyte complex gene expression, follicular arrest and reduced fertility in cows with dominant follicle follicular fluid androgen excess. PLoS One. 9 (10), e110683 (2014).
  24. Koal, T., Schmiederer, D., Pham-Tuan, H., Rohring, C., Rauh, M. Standardized LC-MS/MS based steroid hormone profile analysis. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 129, 129-138 (2012).
  25. Poole, R. K., Brown, A. R., Pore, M. H., Pickworth, C. L., Poole, D. H. Effects of endophyte-infected tall fescue seed and protein supplementation on stocker steers: II. Adaptive and innate immune function. Journal of Animal Science. 97 (10), 4160-4170 (2019).
  26. Laronda, M., et al. Alginate encapsulation supports the growth and differentiation of human primordial follicles within ovarian cortical tissue. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (8), 1013-1028 (2014).
  27. Silber, S. J., et al. A series of monozygotic twins discordant for ovarian failure: ovary transplantation (cortical versus microvascular) and cryopreservation. Human Reproduction. 23 (7), 1531-1537 (2008).
  28. Wiedemann, C., Zahmel, J., Jewgenow, K. Short-term culture of ovarian cortex pieces to assess the cryopreservation outcome in wild fields for genome conservation. BMC Veterinary Research. 9 (37), (2013).
  29. Baufeld, A., Vanselow, J. Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells. Cell and Tissue Research. 354 (3), 869-880 (2013).
  30. Shimizu, T., Miyamoto, A. Progesterone induces the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) 120 and Flk-1, its receptor, in bovine granulosa cells. Animal Reproduction Science. 102 (3-4), 228-237 (2007).
  31. Tepekoy, F., Akkoyunlu, G. The effect of FSH and activin A on Akt and MAPK1/3 phosphorylation in cultured bovine ovarian cortical strips. Journal of Ovarian Research. 9 (13), 1-9 (2016).
  32. Beck, K., Singh, J., Arshud Dar, M., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
  33. Eppig, J. J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals. Reproduction. 122 (6), 829-838 (2001).
  34. Paczkowski, M., Silva, E., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Comparative importance of fatty acid beta-oxidation to nuclear maturation, gene expression, and glucose metabolism in mouse, bovine, and porcine cumulus oocyte complexes. Biology of Reproduction. 88 (5), 1-11 (2013).
  35. Raffel, N., et al. Is ovarian tissue transport at supra-zero temperatures compared to body temperature optimal for follicle survival?. In Vivo. 34 (2), 533-541 (2020).
  36. Duncan, F., et al. Ovarian tissue transport to expand access to fertility preservation: from animals to clinical practice. Reproduction (Cambridge, England). 152 (6), R201-R210 (2016).
  37. Liebenthron, J., et al. Overnight ovarian tissue transportation for centralized cryobanking: a feasible option. Reproductive BioMedicine Online. 38 (5), 740-749 (2019).
  38. Mohammed, B. T., Donadeu, F. X. Bovine granulosa cell culture. Epithelial Cell Culture: Methods and Protocols. , 79-87 (2018).
  39. Langbeen, A., et al. Effects of neutral red assisted viability assessment on the cryotolerance of isolated bovine preantral follicles. Journal of Assisted Reproduction Genetics. 31, 1727-1736 (2014).
  40. Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
  41. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Changes in the transcriptome of bovine ovarian cortex during follicle activation in vitro. Physiological Genomics. 47, 600-611 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 167s r yumurtal k korteksihormonlarfolik llerdoku k lt rk lt r ortamsteroidlersitokinler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır