Combinaison de l’hybridation in situ par fluorescence multiplex avec l’immunohistochimie fluorescente sur des coupes de cerveau de souris fraîches, congelées ou fixes

Résumé

Ce protocole décrit une méthode permettant de combiner l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) et l’immunohistochimie par fluorescence (IHC) dans des coupes de cerveau de souris fraîches, congelées et fixes, dans le but d’obtenir un signal FISH et IHC de fluorescence multimarqueur. L’IHC a ciblé les protéines cytoplasmiques et membranaires.

Résumé

L’hybridation in situ fluorescente (FISH) est une technique moléculaire qui permet d’identifier la présence et la distribution spatiale de transcrits d’ARN spécifiques au sein des cellules. Le phénotypage neurochimique des neurones fonctionnellement identifiés nécessite généralement un marquage simultané avec plusieurs anticorps (protéine de ciblage) à l’aide de l’immunohistochimie (IHC) et une optimisation de l’hybridation in situ (ciblage de l’ARN), en tandem. Il est possible d’obtenir une « signature neurochimique » pour caractériser des neurones particuliers, mais les facteurs de complication incluent la nécessité de vérifier les cibles FISH et IHC avant de combiner les méthodes, et le nombre limité d’ARN et de protéines qui peuvent être ciblés simultanément dans la même section de tissu.

Nous décrivons ici un protocole, utilisant à la fois des préparations de cerveau de souris fraîches congelées et fixes, qui détecte plusieurs ARNm et protéines dans la même section du cerveau à l’aide de RNAscope FISH suivi d’un immunomarquage par fluorescence, respectivement. Nous utilisons la méthode combinée pour décrire le profil d’expression des ARNm de faible abondance (par exemple, le récepteur 1 de la galanine) et des ARNm de grande abondance (par exemple, le transporteur de glycine 2), dans les noyaux du tronc cérébral identifiés immunohistochimiquement.

Les considérations clés pour le marquage des protéines en aval de l’essai FISH vont au-delà de la préparation des tissus et de l’optimisation du marquage de la sonde FISH. Par exemple, nous avons constaté que la spécificité de la liaison et du marquage des anticorps peut être affectée de manière préjudiciable par l’étape de la protéase dans le test de sonde FISH. Les protéases catalysent le clivage hydrolytique des liaisons peptidiques, facilitant l’entrée de la sonde FISH dans les cellules, mais elles peuvent également digérer la protéine ciblée par le test IHC ultérieur, produisant une liaison hors cible. L’emplacement subcellulaire de la protéine ciblée est un autre facteur contribuant au succès de l’IHC après l’essai de la sonde FISH. Nous avons observé que la spécificité de l’IHC était conservée lorsque la protéine ciblée est liée à la membrane, alors que l’IHC ciblant la protéine cytoplasmique nécessitait un dépannage approfondi. Enfin, nous avons constaté que la manipulation des tissus congelés fixes montés sur lame était plus difficile que des tissus congelés frais, mais la qualité de l’IHC était globalement meilleure avec les tissus congelés fixes, lorsqu’ils étaient combinés avec RNAscope.

Introduction

Les protéines et les ARNm qui définissent neurochimiquement des sous-populations de neurones sont généralement identifiés par une combinaison d’immunohistochimie (IHC) et/ou d’hybridation in situ (ISH), respectivement. La combinaison de l’ISH avec les techniques IHC facilite la caractérisation des patrons de colocalisation propres aux neurones fonctionnels (codage neurochimique) en maximisant la capacité de marquage multiplex.

Les méthodes d’ISH fluorescentes (FISH), y compris l’ARNscope, ont une sensibilité et une spécificité plus élevées que les méthodes antérieures de détection de l’ARN telles que l’ISH radioactive et l’ISH chro

Protocole

Un résumé des étapes de prétraitement des tissus se trouve à la figure 1. Toutes les procédures ont été effectuées conformément au Comité de protection et d’éthique des animaux de l’Université de Nouvelle-Galles du Sud, conformément aux directives relatives à l’utilisation et aux soins des animaux à des fins scientifiques (Australian National Health and Medical Research Council).

1. Préparation d’échantillons de tissus cérébraux frais congelés

1. Perfusion transcardique
   1. Préparer un tampon phosphate (PB) hépariné (2500 U/L) de 0,1 M, pH 7,5. Fabriquez de la boue d’éthanol de glace carbonique en mél

Résultats

Ici, nous décrivons une méthode pour combiner le FISH multiplex avec l’IHC fluorescent pour localiser l’expression de l’ARNm pour GalR1 et GlyT2 en utilisant respectivement des tissus frais congelés et fixés au paraformaldéhyde dans le NTS de souris. Les figures 1 et 2 présentent un pipeline des procédures de traitement des tissus, de FISH et d’IHC décrites dans les méthodes. Le tableau 1 présente un résumé des combinaisons d...

Discussion

Dans le domaine des neurosciences, FISH et IHC sont couramment utilisés pour étudier l’organisation spatiale et la signification fonctionnelle de l’ARNm ou des protéines au sein des sous-populations neuronales. Le protocole décrit dans cette étude améliore la capacité de détection simultanée des ARNm et des protéines dans les sections du cerveau. Notre test multiplex combiné FISH-IHC a permis l’identification phénotypique de sous-populations neuronales distinctes dans le NTS dans les préparations de ce...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANIMALS
C57BL/6 mouse	Australian BioResources, Moss Vale	MGI: 2159769
Phox2b-eGFP mouse	Australian BioResources, Moss Vale	MGI: 5776545
REAGENTS
Cyanoacrylate	Loctite
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich	324558
Heparin-Sodium	Clifford Hallam Healthcare	1070760	Consult local veterinary supplier or pharmacy.
Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection	Virbac (Australia) Pty Ltd	N/A	Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol
Molecular grade agarose powder	Sigma Aldrich	5077
OCT Compound, 118mL	Scigen Ltd	4586
Paraformaldehyde, prilled, 95%	Sigma-Aldrich	441244-1KG
Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000  (PVP-40)	Sigma-Aldrich	PVP40
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36930	With or without DAPI
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability)	Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio)	ADV320850	Includes 50x Wash buffer and Protease III
RNase Away	Thermo-Fisher Scientific	7003
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	252859
Tween-20, for molecular biology	Sigma-Aldrich	P9416
EQUIPMENT
Benchtop incubator	Thermoline scientific micro incubator	Model: TEI-13G
Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm	Ted Pella	15050
Cryostat	Leica	CM1950
Drawing-up needle (23 inch gauge)	BD	0288U07
Hydrophobic Barrier Pen	Vector labs	H-4000
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes	Kimberley Clark Professional	34120
Olympus BX51	Olympus	BX-51
Peristaltic pump	Coleparmer Masterflex	L/S Series
Retiga 2000R Digital Camera	QImaging	RET-2000R-F-CLR	colour camera
SuperFrost Plus Glass Slides (White)	Thermo-Fisher Scientific	4951PLUS4
Vibrating Microtome (Vibratome)	Leica	VT1200S
Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter	Merck	WHA1001110
SOFTWARES
CorelDRAW	Corel Corporation	Version 7
FIJI (ImageJ Distribution)	Open Source/GNU General Public Licence (GPL)	N/A	ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z   and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019
PRIMARY ANTIBODIES
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody	Millipore Sigma	AB1542	Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1	Millipore Sigma	MAB318	Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528
Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody	Sigma-Aldrich	ABN100	Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394
GFP Antibody	Novus Biologicals	NB600-308	Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058
Phox2b Antibody (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-376997	Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765
SECONDARY ANTIBODIES
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	711-545-152	Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584
AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	713-155-147	Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	705-175-147	Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	715-175-151	Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	713-175-147	Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730
RNASCOPE PROBES
Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe	ACDBio	448821-C1	targets bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2)
Glycine transporter 2 oligonucleotide probe	ACDBio	409741-C3	targets bp 925 - 2153 (Genebank ref: NM_148931.3)
Phox2b oligonucleotide probe	ACDBio	407861-C2	targets bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3)