Combinaison de l’hybridation in situ par fluorescence multiplex avec l’immunohistochimie fluorescente sur des coupes de cerveau de souris fraîches, congelées ou fixes

L’hybridation in situ fluorescente (FISH) est une technique moléculaire qui permet d’identifier la présence et la distribution spatiale de transcrits d’ARN spécifiques au sein des cellules. Le phénotypage neurochimique des neurones fonctionnellement identifiés nécessite généralement un marquage simultané avec plusieurs anticorps (protéine de ciblage) à l’aide de l’immunohistochimie (IHC) et une optimisation de l’hybridation in situ (ciblage de l’ARN), en tandem. Il est possible d’obtenir une « signature neurochimique » pour caractériser des neurones particuliers, mais les facteurs de complication incluent la nécessité de vérifier les cibles FISH et IHC avant de combiner les méthodes, et le nombre limité d’ARN et de protéines qui peuvent être ciblés simultanément dans la même section de tissu.

Nous décrivons ici un protocole, utilisant à la fois des préparations de cerveau de souris fraîches congelées et fixes, qui détecte plusieurs ARNm et protéines dans la même section du cerveau à l’aide de RNAscope FISH suivi d’un immunomarquage par fluorescence, respectivement. Nous utilisons la méthode combinée pour décrire le profil d’expression des ARNm de faible abondance (par exemple, le récepteur 1 de la galanine) et des ARNm de grande abondance (par exemple, le transporteur de glycine 2), dans les noyaux du tronc cérébral identifiés immunohistochimiquement.

Les considérations clés pour le marquage des protéines en aval de l’essai FISH vont au-delà de la préparation des tissus et de l’optimisation du marquage de la sonde FISH. Par exemple, nous avons constaté que la spécificité de la liaison et du marquage des anticorps peut être affectée de manière préjudiciable par l’étape de la protéase dans le test de sonde FISH. Les protéases catalysent le clivage hydrolytique des liaisons peptidiques, facilitant l’entrée de la sonde FISH dans les cellules, mais elles peuvent également digérer la protéine ciblée par le test IHC ultérieur, produisant une liaison hors cible. L’emplacement subcellulaire de la protéine ciblée est un autre facteur contribuant au succès de l’IHC après l’essai de la sonde FISH. Nous avons observé que la spécificité de l’IHC était conservée lorsque la protéine ciblée est liée à la membrane, alors que l’IHC ciblant la protéine cytoplasmique nécessitait un dépannage approfondi. Enfin, nous avons constaté que la manipulation des tissus congelés fixes montés sur lame était plus difficile que des tissus congelés frais, mais la qualité de l’IHC était globalement meilleure avec les tissus congelés fixes, lorsqu’ils étaient combinés avec RNAscope.