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Ce protocole décrit une méthode permettant de combiner l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) et l’immunohistochimie par fluorescence (IHC) dans des coupes de cerveau de souris fraîches, congelées et fixes, dans le but d’obtenir un signal FISH et IHC de fluorescence multimarqueur. L’IHC a ciblé les protéines cytoplasmiques et membranaires.
L’hybridation in situ fluorescente (FISH) est une technique moléculaire qui permet d’identifier la présence et la distribution spatiale de transcrits d’ARN spécifiques au sein des cellules. Le phénotypage neurochimique des neurones fonctionnellement identifiés nécessite généralement un marquage simultané avec plusieurs anticorps (protéine de ciblage) à l’aide de l’immunohistochimie (IHC) et une optimisation de l’hybridation in situ (ciblage de l’ARN), en tandem. Il est possible d’obtenir une « signature neurochimique » pour caractériser des neurones particuliers, mais les facteurs de complication incluent la nécessité de vérifier les cibles FISH et IHC avant de combiner les méthodes, et le nombre limité d’ARN et de protéines qui peuvent être ciblés simultanément dans la même section de tissu.
Nous décrivons ici un protocole, utilisant à la fois des préparations de cerveau de souris fraîches congelées et fixes, qui détecte plusieurs ARNm et protéines dans la même section du cerveau à l’aide de RNAscope FISH suivi d’un immunomarquage par fluorescence, respectivement. Nous utilisons la méthode combinée pour décrire le profil d’expression des ARNm de faible abondance (par exemple, le récepteur 1 de la galanine) et des ARNm de grande abondance (par exemple, le transporteur de glycine 2), dans les noyaux du tronc cérébral identifiés immunohistochimiquement.
Les considérations clés pour le marquage des protéines en aval de l’essai FISH vont au-delà de la préparation des tissus et de l’optimisation du marquage de la sonde FISH. Par exemple, nous avons constaté que la spécificité de la liaison et du marquage des anticorps peut être affectée de manière préjudiciable par l’étape de la protéase dans le test de sonde FISH. Les protéases catalysent le clivage hydrolytique des liaisons peptidiques, facilitant l’entrée de la sonde FISH dans les cellules, mais elles peuvent également digérer la protéine ciblée par le test IHC ultérieur, produisant une liaison hors cible. L’emplacement subcellulaire de la protéine ciblée est un autre facteur contribuant au succès de l’IHC après l’essai de la sonde FISH. Nous avons observé que la spécificité de l’IHC était conservée lorsque la protéine ciblée est liée à la membrane, alors que l’IHC ciblant la protéine cytoplasmique nécessitait un dépannage approfondi. Enfin, nous avons constaté que la manipulation des tissus congelés fixes montés sur lame était plus difficile que des tissus congelés frais, mais la qualité de l’IHC était globalement meilleure avec les tissus congelés fixes, lorsqu’ils étaient combinés avec RNAscope.
Les protéines et les ARNm qui définissent neurochimiquement des sous-populations de neurones sont généralement identifiés par une combinaison d’immunohistochimie (IHC) et/ou d’hybridation in situ (ISH), respectivement. La combinaison de l’ISH avec les techniques IHC facilite la caractérisation des patrons de colocalisation propres aux neurones fonctionnels (codage neurochimique) en maximisant la capacité de marquage multiplex.
Les méthodes d’ISH fluorescentes (FISH), y compris l’ARNscope, ont une sensibilité et une spécificité plus élevées que les méthodes antérieures de détection de l’ARN telles que l’ISH radioactive et l’ISH chro....
Un résumé des étapes de prétraitement des tissus se trouve à la figure 1. Toutes les procédures ont été effectuées conformément au Comité de protection et d’éthique des animaux de l’Université de Nouvelle-Galles du Sud, conformément aux directives relatives à l’utilisation et aux soins des animaux à des fins scientifiques (Australian National Health and Medical Research Council).
1. Préparation d’échantillons de tissus cérébraux frais congelés
Ici, nous décrivons une méthode pour combiner le FISH multiplex avec l’IHC fluorescent pour localiser l’expression de l’ARNm pour GalR1 et GlyT2 en utilisant respectivement des tissus frais congelés et fixés au paraformaldéhyde dans le NTS de souris. Les figures 1 et 2 présentent un pipeline des procédures de traitement des tissus, de FISH et d’IHC décrites dans les méthodes. Le tableau 1 présente un résumé des combinaisons d.......
Dans le domaine des neurosciences, FISH et IHC sont couramment utilisés pour étudier l’organisation spatiale et la signification fonctionnelle de l’ARNm ou des protéines au sein des sous-populations neuronales. Le protocole décrit dans cette étude améliore la capacité de détection simultanée des ARNm et des protéines dans les sections du cerveau. Notre test multiplex combiné FISH-IHC a permis l’identification phénotypique de sous-populations neuronales distinctes dans le NTS dans les préparations de ce.......
Ces travaux ont été financés par la subvention du projet de découverte du Conseil australien de la recherche DP180101890 et la subvention de projet de la Fondation de recherche médicale Rebecca L. Cooper PG2018110
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
ANIMALS | |||
C57BL/6 mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 2159769 | |
Phox2b-eGFP mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 5776545 | |
REAGENTS | |||
Cyanoacrylate | Loctite | ||
Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
Heparin-Sodium | Clifford Hallam Healthcare | 1070760 | Consult local veterinary supplier or pharmacy. |
Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | N/A | Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol |
Molecular grade agarose powder | Sigma Aldrich | 5077 | |
OCT Compound, 118mL | Scigen Ltd | 4586 | |
Paraformaldehyde, prilled, 95% | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000 (PVP-40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | With or without DAPI |
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability) | Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio) | ADV320850 | Includes 50x Wash buffer and Protease III |
RNase Away | Thermo-Fisher Scientific | 7003 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
Tween-20, for molecular biology | Sigma-Aldrich | P9416 | |
EQUIPMENT | |||
Benchtop incubator | Thermoline scientific micro incubator | Model: TEI-13G | |
Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm | Ted Pella | 15050 | |
Cryostat | Leica | CM1950 | |
Drawing-up needle (23 inch gauge) | BD | 0288U07 | |
Hydrophobic Barrier Pen | Vector labs | H-4000 | |
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes | Kimberley Clark Professional | 34120 | |
Olympus BX51 | Olympus | BX-51 | |
Peristaltic pump | Coleparmer Masterflex | L/S Series | |
Retiga 2000R Digital Camera | QImaging | RET-2000R-F-CLR | colour camera |
SuperFrost Plus Glass Slides (White) | Thermo-Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
Vibrating Microtome (Vibratome) | Leica | VT1200S | |
Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter | Merck | WHA1001110 | |
SOFTWARES | |||
CorelDRAW | Corel Corporation | Version 7 | |
FIJI (ImageJ Distribution) | Open Source/GNU General Public Licence (GPL) | N/A | ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 |
PRIMARY ANTIBODIES | |||
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Millipore Sigma | AB1542 | Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755 |
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1 | Millipore Sigma | MAB318 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528 |
Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody | Sigma-Aldrich | ABN100 | Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394 |
GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-308 | Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058 |
Phox2b Antibody (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-376997 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765 |
SECONDARY ANTIBODIES | |||
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584 |
AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-155-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725 |
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415 |
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678 |
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-175-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730 |
RNASCOPE PROBES | |||
Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe | ACDBio | 448821-C1 | targets bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2) |
Glycine transporter 2 oligonucleotide probe | ACDBio | 409741-C3 | targets bp 925 - 2153 (Genebank ref: NM_148931.3) |
Phox2b oligonucleotide probe | ACDBio | 407861-C2 | targets bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3) |
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