Stima del contenuto cristallino di cellulosa della biomassa vegetale utilizzando il metodo Updegraff

Riepilogo

Il metodo Updegraff è il metodo più utilizzato per la stima della cellulosa. Lo scopo principale di questa dimostrazione è quello di fornire un protocollo Updegraff dettagliato per la stima del contenuto di cellulosa nei campioni di biomassa vegetale.

Abstract

La cellulosa è il polimero più abbondante sulla Terra generato dalla fotosintesi e la componente portante principale delle pareti cellulari. La parete cellulare svolge un ruolo significativo nella crescita e nello sviluppo delle piante fornendo forza, rigidità, velocità e direzione della crescita cellulare, mantenimento della forma cellulare e protezione dagli stressanti biotici e abiotici. La parete cellulare è composta principalmente da cellulosa, lignina, emicellulosa e pectina. Recentemente le pareti cellulari delle piante sono state prese di mira per la produzione di biocarburanti e bioenergia di seconda generazione. In particolare, il componente di cellulosa della parete cellulare vegetale viene utilizzato per la produzione di etanolo cellulosico. La stima del contenuto di cellulosa nella biomassa è fondamentale per la ricerca fondamentale e applicata sulle pareti cellulari. Il metodo Updegraff è semplice, robusto e il metodo più utilizzato per la stima del contenuto cristallino di cellulosa della biomassa vegetale. La frazione della parete cellulare grezza insolubile alcool al momento del trattamento con reagente di Updegraff elimina le frazioni di emicellulosa e lignina. Successivamente, la frazione di cellulosa resistente al reagente updegraff viene sottoposta a trattamento con acido solforico per idrolizzare l'omopolimero di cellulosa in unità di glucosio monomerico. Una linea di regressione viene sviluppata utilizzando varie concentrazioni di glucosio e utilizzata per stimare la quantità di glucosio rilasciato sull'idrolisi della cellulosa nei campioni sperimentali. Infine, il contenuto di cellulosa è stimato in base alla quantità di monomeri di glucosio per saggio di antronrone colorimetrico.

Introduzione

La cellulosa è la componente portante primaria delle pareti cellulari, presente sia nelle pareti cellulari primarie che secondarie. La parete cellulare è una matrice extracellulare che circonda le cellule vegetali ed è composta principalmente da proteine di cellulosa, lignina, emicellulosa, pectina e matrice. Circa un terzo della biomassa vegetale è la cellulosa¹ e svolge ruoli significativi nella crescita e nello sviluppo delle piante fornendo forza, rigidità, velocità e direzione della crescita cellulare, mantenimento della forma cellulare e protezione dagli stressanti biotici e abiotici. La fibra di cotone contiene il 95% di contenuto di cellulosa^{2, mentre} gli alberi contengono dal 40% al 50% di cellulosa a seconda delle specie vegetali e dei tipi^{di organo 3}. La cellulosa è composta da unità ripetute di cellobiosio, un disaccaride di residui di glucosio collegato da β-1,4 legami glicosidici⁴. L'etanolo cellulosico è prodotto dal glucosio derivato dalla cellulosa presente nelle pareti cellulari delle piante⁵. La fibra cellulosica è composta da diverse micro fibrille in cui ogni micro fibrillazione funge da nucleo con monomeri di glucosio 500-15000^1,6. L'omopolimero della cellulosa è sintetizzato da complessi di cellulosa sintasi incorporati nella membrana plasmatica (CSC)^1,7. Le singole proteine della cellulosa sintasi A (CESA) sintetizzano catene di glucano e le catene glucane adiacenti sono collegate da legami idrogeno per formare cellulosa cristallina^1,8. La cellulosa esiste in diverse forme cristalline con due forme predominanti, la cellulosa Iα e la cellulosa Iβ come forme native⁹. Nelle piante superiori, la cellulosa esiste in forma di cellulosa Iβ mentre la cellulosa vegetale inferiore esiste nella forma Iα^10,11. Nel complesso, la cellulosa svolge un ruolo significativo nell'impartire forza e rigidità alle pareti delle cellule vegetali.

I biocarburanti di prima generazione sono prodotti principalmente da amido di mais, zuccheri di canna e zuccheri di barbabietola, che sono fonti alimentari, mentre i biocarburanti di seconda generazione si concentrano sulla produzione di biocarburanti da materiale da parete a biomassa vegetale non^{alimentare 12}. Una stima accurata del contenuto cristallino di cellulosa è importante non solo per la ricerca fondamentale sulla biosintesi della cellulosa e sulla dinamica delle pareti cellulari, ma anche per la ricerca applicata sui biocarburanti e sui bio prodotti. Vari metodi sono stati sviluppati e ottimizzati per la stima della cellulosa nella biomassa vegetale, e il metodo Updegraff è il metodo più utilizzato per la stima della cellulosa. Il primo metodo riportato per la stima della cellulosa fu quello di Cross e Bevan nel 1908^13. Il metodo si basava sul principio della clorazione alternativa e dell'estrazione mediante solfato di sodio. Tuttavia, la cellulosa ottenuta con i protocolli originali e modificati del metodo Cross e Bevan ha mostrato la contaminazione di piccole frazioni di lignina oltre a una notevole quantità di xili e mannani¹⁴. Nonostante diverse modifiche per rimuovere la lignina e le emicellulosi dalla frazione di cellulosa, il metodo Cross-Bevan mantenne una notevole quantità di mannani insieme alla cellulosa. Successivamente, il metodo di Kurschner fu sviluppato impiegando acido nitrico ed etanolo per estrarre la cellulosa¹⁵. Questo metodo affermava che la lignina totale e il 75% dei pentosani erano stati rimossi, ma i veri risultati della cellulosa erano gli stessi stimati con il metodo di clorazione di Cross e Bevan. Un altro metodo (Norman e Jenkins) è stato sviluppato impiegando metanolo-benzene, solfato di sodio e ipoclorito di sodio per estrarre la cellulosa¹⁶. Questo metodo ha anche mantenuto una frazione di lignina (3%) e quantità significative di pentosani che portano a una stima accurata della cellulosa. Più tardi, Kiesel e Semiganowsky usarono un diverso approccio alla cellulosa idrolizzata usando l'80% di acido solforico concentrato, e gli zuccheri ridotti idrolizzati furono stimati con il metodo^{17 di}Bertrand. I due metodi, Waksman's e Stevens¹⁸ e Salo¹⁴,^{19 che}sono stati sviluppati sulla base del metodo di Kiesel e Semiganowsky, hanno anche prodotto il 4-5% in meno di contenuto di cellulosa rispetto ai metodi^{precedenti 20}.

Il metodo Updegraff è il metodo più utilizzato per la stima del contenuto cristallino di cellulosa. Questo metodo è stato descritto per la prima volta da Updegraff per la misurazione della cellulosa nel 1969²¹. Il metodo Updegraff integra il metodo Kurschner (uso di acido nitrico), i metodi Kiesel e Seminowsky (idrolisi della cellulosa nei monomeri di glucosio usando acido solforico) con alcune modifiche, e il saggio di antronrone di Viles e Silverman per una semplice stima colorimetrica del contenuto di glucosio e cellulosa cristallina²². Il principio di questo metodo è l'uso di acido acetico e acido nitrico (reagente di Updegraff) per eliminare l'emicellulosa e la lignina dai tessuti vegetali omogeneizzati, che lascia cellulosa acetica / nitrica resistente all'acido per un'ulteriore^{lavorazione e stima 15}. La cellulosa acetica/nitrica resistente all'acido viene trattata con il 67% di acido solforico per rompere la cellulosa in monomeri di glucosio e i monomeri di glucosio rilasciati sono stimati per test di antronrone^21,23. Diverse modifiche del metodo Updegraff originale sono state utilizzate per semplificare la procedura e la stima della cellulosa mediante test di antronrone²⁴. In generale, questo metodo può essere suddiviso in cinque fasi. Nella prima fase, viene preparato il materiale vegetale. Nella seconda fase, la parete cellulare grezza è separata dalla biomassa totale, poiché la cellulosa è il componente chiave delle pareti cellulari delle piante. Più tardi, nella terza fase, la cellulosa viene separata dai componenti della parete cellulare non cellulosica trattando con reagente di Updegraff. Nella quarta fase, la cellulosa acetica/nitrica resistente all'acido viene suddivisa in monomeri di glucosio mediante trattamento con acido solforico. Il trattamento con acido solforico della cellulosa si traduce nella formazione di composti 5-idrossimetilfurfurali dalla reazione dei monomeri di glucosio con acido solforico. Infine, nell'ultima fase, l'antronrone genera un complesso blu verdastro bollendo con il composto furfurale generato nella fase^{precedente 25}. Questo metodo colorimetrico basato sull'antronrone fu usato per la prima volta nel 1942 da Dreywood. L'antronrone è un colorante che identifica composti furfurali di pentosio ed esosio disidratati come 5-idrossimetilfurfurolo, in condizioni acide. La reazione con esosio produce un colore intenso e una migliore risposta rispetto alle pentosi²⁵. La quantità di glucosio legato viene misurata dall'assorbanza dello spettrofotometro a 620 nm e l'intensità del complesso blu verdastro è direttamente proporzionale alla quantità di zucchero nel campione. I valori di assorbanza misurati sono stati confrontati con una linea di regressione della curva standard di glucosio per calcolare la concentrazione di glucosio del campione. Il contenuto misurato di glucosio è stato utilizzato per stimare il contenuto di cellulosa della biomassa vegetale.

Protocollo

1. Preparazione sperimentale

1. Macinare materiale vegetale essiccato in una polvere fine.
2. Tampone di solubilizzazione proteica (PSB): Preparare soluzioni stock di 1 M Tris (pH 8.8), 0,5 M etilendiamminatetraacetico acido (EDTA) (pH 8.0) e autoclave. Creare tampone psb fresco da queste soluzioni stock con concentrazioni finali di Tris da 50 mM, EDTA da 0,5 mM e solfato di dodecil di sodio al 10% (SDS) in acqua sterile.
3. Preparare 100 mL di etanolo al 70% (v/v): 70 mL di etanolo al 100% e 30 mL di acqua sterile.
4. Preparare 100 mL di metanolo: cloroformio in un rapporto 1:1 (metanolo da 50 mL e cloroformio da 50 mL).
5. Preparare 82,5 mL di reagente Updegraff. Aggiungere 75 mL di acido acetico all'80% a 7,5 mL di acido nitrico in modo che il rapporto finale tra acqua: acido acetico: acido nitrico sia in 2:8:1 (v/v). Per preparare l'80% di acido acetico, sciogliere 80 mL di acido acetico glaciale in 20 mL di acqua sterile (v/v).
6. Preparare uno stock fresco di 1 mg/mL di soluzione di glucosio. Sciogliere 10 mg di glucosio in 10 mL di acqua (w/v).
7. Per preparare 100 mL di acido solforico al 67% (v/v), aggiungere 67 mL di acido solforico concentrato a 33 mL di acqua. Utilizzare sempre una bottiglia di vetro e aggiungere l'acido lentamente all'acqua. Questo passaggio è esotermico (rilascia calore). Quindi, preparare questa soluzione sul ghiaccio e raffreddare in frigorifero per almeno 2 ore prima dell'uso.
8. Preparare un'antronrone fresco dello 0,2% (w/v) per ogni lotto di campioni sperimentali. Pesare 0,2 g di antronrone e sciogliere in 100 ml di acido solforico concentrato prerimortato in una bottiglia di vetro avvolta con foglio di alluminio. Conservare in frigorifero per 1-2 ore prima dell'uso.
   NOTA: L'acido solforico concentrato pre-agghiacciante in frigorifero il giorno dell'esperimento e la preparazione fresca dell'antronrone è altamente raccomandata per una stima accurata del contenuto di glucosio.

2. Preparazione di materiale da biomassa vegetale

1. Raccogliere campioni di biomassa vegetale da linee sperimentali di cotone di 2 mesi coltivate nella serra con le stesse condizioni di crescita, la stessa fase di sviluppo, la stessa posizione delle piante e lo stesso tipo di tessuto (foglia / gambo / radice).
   NOTA: Raccogliere almeno tre repliche biologiche per ciascun campione. Lavarli accuratamente con acqua per rimuovere tutto lo sporco dal tessuto radicale.
2. Tessuto radicale ad aria secca per 2 giorni su tovaglioli di carta a temperatura ambiente per rimuovere il contenuto di umidità (Figura 1).
   NOTA: Tessuto desiderato ad asciugatura ad aria per la stima della cellulosa per prevenire qualsiasi contaminazione fungina.
3. Posizionare i campioni radice in singoli contenitori. Quindi etichettarli e asciugarli nell'incubatrice a 49 °C per 10 giorni(Tabella dei Materiali).
   NOTA: In alternativa, un essiccatore a congelatore può essere utilizzato per asciugare il tessuto vegetale in meno tempo (1 o 2 giorni) senza causare cambiamenti chimici al materiale da biomassa vegetale.
4. Tagliare i campioni essiccati in piccoli pezzi, congelarli in azoto liquido e macinare in polvere fine uniforme utilizzando una malta e un pestello, un mulino congelatore o una smerigliatrice a biomassa(Figura 1).
   NOTA: Il congelatore è stato utilizzato ad una velocità di 10 cps per 3 cicli.
5. Raccogliere il tessuto a terra (Figura 2) e procedere con l'estrazione della parete cellulare.
   NOTA: Il processo può essere messo in pausa a questo punto immagazzinando i campioni in contenitori ermetici a temperatura ambiente.

3. Estrazione di pareti di cellule grezze dalla biomassa vegetale

NOTA: Le pareti cellulari vegetali contengono cellulosa, lignina, componenti non cellulosa, pectina, proteine matriciale, composti fenolici e acqua²⁶. Poiché la cellulosa è presente nelle pareti cellulari, il primo passo è separare il componente della parete cellulare dai componenti della parete non cellulare della biomassa vegetale²⁶.

1. Etichettare e pesare singoli tubi vuoti da 2 ml prima di iniziare il processo di estrazione della parete cellulare.
2. Prendere nota dei pesi dei tubi vuoti in un quaderno da laboratorio prima di procedere ulteriormente.
3. Pesare 20 mg di tessuto in polvere dal passo 2.5 e trasferirlo in tubi pre-pesati da 2 ml ed etichettarli.
4. Aggiungere 1 mL di tampone di solubilizzazione proteica (PSB) (50 mM Tris cloridrato (HCl) tampone pH 8.8, 0,5 mM EDTA e 10% sodio dodecil solfato (SDS) per solubilizzare le proteine. Vortice e centrifuga a 25.200 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT). Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante e salvare il pellet.
   NOTA: Il supernatante può essere salvato se è necessario analizzare il componente proteico.
5. Ripetere il passaggio 3.4 altre due volte.
6. Al pellet trattenuto aggiungere 1 mL di acqua distillata e vortice. Centrifugare a 25.200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) e rimuovere il supernatante.
7. Ripetere il passaggio 3.6 altre due volte.
8. Aggiungere 1 mL di etanolo al pellet, al vortice e scaldarlo a 70 °C per 1 h in un bagno d'acqua/blocco di calore per rimuovere i componenti solubili e l'amido dai campioni. Vortice e centrifuga a 25.200 x g per 5 min a RT. Scartare il supernatante e salvare il pellet.
9. Ripetere il passaggio 3.8 un'altra volta.
10. Al pellet aggiungere 1 mL di metanolo e vortice al 100%. Centrifugare a 25.200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) e rimuovere il supernatante.
11. Aggiungere 1 mL di cloroformio/metanolo (cloroformio e metanolo in rapporto 1:1) al pellet e al vortice. Centrifugare a 25.200 x g per 5 minuti a RT e rimuovere il supernatante. L'aggiunta di metanolo e solvente cloroformio solubilizza e rimuove la frazione lipidica dalla biomassa²⁷.
12. Al pellet aggiungere 1 mL di acetone e vortice al 100%. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Centrifugare a 25.200 x g per 5 minuti a RT e rimuovere il supernatante. L'acetone rimuove pigmenti come la clorofilla e gli acidi grassi liberi dalla biomassa^28,29.
13. Asciugare il pellet a 37 °C durante la notte o procedere ulteriormente mediante essiccazione sottovuoto.
    NOTA: Il pellet essiccato è la parete cellulare grezza utilizzata per la stima della cellulosa cristallina. Il processo può essere messo in pausa a questo punto o procedere ulteriormente utilizzando l'essiccatore sottovuoto per l'essiccazione dei campioni.

4. Trattamento con reagente updegraff (acido acetico e nitrico) per rimuovere componenti non cellulosici

NOTA: Il protocollo prevede l'uso di acidi e altre sostanze chimiche. Indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) durante tutto il processo.

1. Misurare 5 mg del pellet di parete a celle grezze essiccate in un tubo chiuso a vite fresco da 2 ml. Si noti il peso esatto (Figura 3)³⁰.
2. Includere un controllo positivo a questo punto. Utilizzare 2 mg di carta da filtro (Tabella dei materiali) come controllo positivo che produce l'80% di contenuto di cellulosa.
3. Aggiungere 1,5 mL del reagente Updegraff ai 5 mg pesati di estratto di parete cellulare e controllo positivo. Mescolare con il vortice.
   NOTA: Il controllo positivo deve essere elaborato allo stesso modo dei campioni sperimentali a partire da questa fase. Questo passaggio deve essere effettuato nella cappa aspirante con adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI).
   ATTENZIONE: Questo passaggio deve essere eseguito in tubi a vite per evitare spruzzi di campione e spruzzi dei tubi. Devono essere incluse tre repliche biologiche di ciascun campione insieme a tre repliche per il controllo positivo.
4. Scaldare le sospensioni a 100 °C per 30 minuti in un bagno d'acqua bollente e raffreddare su una panchina per 10 minuti. Centrifugare a 25.200 x g per 10 min a RT. Rimuovere il supernatante mediante centrifugazione e salvare il pellet.
   NOTA: I rifiuti generati devono essere raccolti separatamente per solventi organici, acido solforico e reagente di Updegraff (acido acetico e acido nitrico). I rifiuti con acido acetico e acido nitrico devono essere conservati a temperature fredde con tappi ventilati e mai mescolati con altri solventi organici e altri acidi per evitare qualsiasi esplosione.
5. Aggiungere 1 mL di acqua al pellet. Centrifuga a 25.200 x g per 10 min a RT. Rimuovere 500 μL del supernatante e aggiungere 1 ml di acetone al tubo.
6. Centrifugare a 25.200 x g per 5 min a RT. Rimuovere 1 ml di supernatante e aggiungere 1 ml di acetone al tubo e centrifuga a 25.200 x g per 5 minuti a RT.
7. Dopo la centrifugazione, rimuovere tutto il supernatante e sospendere il pellet in 1 mL di acetone. Incubare i tubi a temperatura ambiente per 5 minuti e girare a 25.200 x g per 5 minuti a RT.
8. Scartare il supernatante e salvare il pellet. Asciugare il pellet a 37 °C durante la notte(figura 3).
   NOTA: Il processo può essere messo in pausa a questo punto o continuare ulteriormente utilizzando l'essiccatore sottovuoto per l'asciugatura e procedere al passaggio successivo.

5. Idrolisi della cellulosa per acido per produrre unità monomero di glucosio

1. Aggiungere 1 mL di acido solforico al 67% al pellet essiccato. Vortice per mescolare completamente il pellet nell'acido.
2. Agitare i tubi a temperatura ambiente per 1 h per sciogliere il pellet di cellulosa nel 67% di acido solforico.
   NOTA: In alternativa, la solubilizzazione del pellet di cellulosa nel 67% di acido solforico può essere migliorata mediante sonicazione di ciascun campione per 10 minuti dopo 30 minuti di incubazione nello shaker. Dopo la sonicazione, i campioni possono essere ri-incubati nello shaker a RT. Tuttavia, abbiamo osservato una completa solubilità del pellet di cellulosa senza sonicazione quando iniziamo con 5 mg di estratto grezzo di parete cellulare (Figura 3). Questa procedura ha funzionato bene per vari campioni di biomassa^{vegetale 3}.

6. Misurazione del contenuto di glucosio mediante il dosaggio dell'antronrone e stima del contenuto di cellulosa

1. In questa fase, la cellulosa è sotto forma di monomeri di glucosio liberi. Determinare la quantità di cellulosa misurando la quantità di glucosio presente nel campione mediante spettrofotometria.
2. Prendere 10 μL del campione dal passaggio 5 e aggiungerlo a 490 μL di acqua distillata sterile per effettuare una diluizione di ciascun campione a 500 μL.
3. Aggiungere 1 ml di reagente di antronrone appena preparato allo 0,2% ad ogni tubo e mescolare immediatamente con vortice.
4. Far bollire i campioni a 100 °C per 10 minuti e raffreddare i tubi sul ghiaccio per 5 minuti. Trasferire 200 μL di ogni campione in tre pozzali di una piastra di 96 pozza. Caricare la piastra del pozzo 96 in uno spettrofotometro per misurare l'assorbanza a 620 nm.
   NOTA: Per l'ebollizione ad alta temperatura, utilizzare tubi con tappo a vite per prevenire spruzzi di sostanze chimiche nocive ed evitare la perdita di campioni.

7. Preparazione della curva standard del glucosio

1. Per preparare lo standard di glucosio, fare uno stock fresco di 1 mg/mL di glucosio sciogliendo 10 mg di glucosio in 10 mL di acqua distillata sterile. Aggiungere questa soluzione stock di 1 mg/mL in incrementi di 20 μL (0, 20, 40, 60, 80.100.120.140, 160, 180 μL) all'acqua distillata sterile (volume totale 1 mL) per preparare standard di glucosio che vanno da 0 μg a 180 μg/mL di concentrazione(figura 3). Vortice ogni standard di glucosio dopo l'aggiunta di acqua sterile.
2. Da queste 10 diverse concentrazioni, aliquota 500 μL di ogni concentrazione di glucosio in un tubo chiuso a vite fresco da 2 ml.
3. Aggiungere 1 ml di antronrone allo 0,2% appena preparato ad ogni tubo e mescolare immediatamente con vortice. Incubare sul ghiaccio e far bollire a 100 °C per 10 minuti seguito da incubazione sul ghiaccio per 5 min²³.
4. Trasferire 200 μL di ogni norma in tre pozzi in una piastra di 46 micro titer a 96 pozzetti per tre repliche tecniche e misurare l'assorbanza a 620 nm(Figura 3).
5. Sviluppare una curva standard del glucosio tracciando diverse concentrazioni di glucosio (da 0 a 180 μg/mL) rispetto ai valori di assorbanza normalizzati a 620 nm(figura 7). Utilizzare la linea di regressione Y= mx+c generata dai valori di assorbanza per calcolare il contenuto di cellulosa nei campioni preparati.
   NOTA: Le norme sul glucosio devono essere preparate al momento per ogni serie di esperimenti. La concentrazione del glucosio dovrebbe essere aumentata se i valori di OD sono troppo alti/ bassi in modo che questi valori rientrano nell'intervallo dei valori standard di assorbanza della curva. La linea di regressione genera diversi valori m e c in base agli standard di glucosio utilizzati per ogni lotto di campioni. Mescolare i tubi subito dopo l'aggiunta di^{antronrone 23}. L'antronrone, i campioni diluiti e gli standard preparati sono sempre stati tenuti freddi fino a quando il dosaggio di antronrone non è stato eseguito a causa della natura esotermica di questa reazione.

Risultati

Per questo studio sono state selezionate piante di cotone coltivate nella casa verde. Per l'analisi comparativa del contenuto di cellulosa sono state selezionate due diverse linee sperimentali di cotone. Per ogni linea sperimentale, il tessuto radicale è stato raccolto da tre repliche biologiche. Un totale di 500 mg di tessuto è stato omogeneizzato e 20 mg di esso è stato utilizzato per l'estrazione di pareti cellulari grezze. Successivamente, 5 mg di estratto grezzo di parete cellulare sono stati utilizzati per il tr...

Discussione

Le fibre di cotone sono fibre naturali prodotte dal semi di cotone. La fibra di cotone è una singola cella con ~95% di contenuto di cellulosa² con alto contenuto cristallino di cellulosa con ampie applicazioni nell'industria^{tessile 31}. Poiché, la fibra di cotone contiene ~ 95% di cellulosa, abbiamo usato tessuti di radice di cotone per la dimostrazione della stima del contenuto cristallino di cellulosa. I tessuti di radice di cotone sono moderatamente ricchi di contenuto ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Fisher Chemical	A18-500	Used in the protocol
Anthrone	Sigma Aldrich	90-44-8	For colorimetric assay
Centrifuge	Eppendorf	5424	For centrifugation
Chloroform	Mallinckrodt	67-66-3	Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	6381-92-6	Used in the protocol
Ethanol	Millipore Sigma	EM-EX0276-4S	Used in the protocol
Filter paper	Whatman	1004-090	Positive control
Glacial acetic acid	Sigma	SKU A6283	Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5	Eppendorf	13527550	For controlled temperatures
Incubator	Fisherbrand	150152633	Used for drying plant sample
Measuring Scale	Mettler Toledo	30243386	For specific quantities
Methanol 100 %	Fisher Chemical	A412-500	Used in the protocol
Microplate (96 well)	Evergreen Scientific	222-8030-01F	For anthrone assay
Nitric acid	Sigma Aldrich	695041	Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes	BioSpec Products	10831	For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector)	Beckmancoulter DTX880	1000814	For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill	Spex Sample Prep	68-701-15	For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid	J.T.Baker	02-004-382	Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	151-21-3	Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL)	Fisher Scientific	05-408-138	Used in the protocol
Tris Hydrochloride	Sigma Aldrich	1185-53-1	Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977	Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus)	Eppendorf	22820001	For drying samples
Vortex mixer	Fisherbrand	14-955-151	For mixing
Waterbath	Thermoscientific	TSGP02PM05	For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper	Fisher Scientific	09-898-12A	Used in the protocol