著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

このプロトコルは、強力な3Dイメージング技術であるシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)を使用するための日常的な方法を概説しています。SBF-SEMヒンジの適用に成功し、適切な固定および組織染色技術に加え、イメージング設定を慎重に検討します。このプロトコルには、このプロセス全体に対する実用的な考慮事項が含まれています。

要約

シリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)は、数百から数千の連続登録された超構造画像の収集を可能にし、組織微小解剖学の前例のない3次元ビューを提供します。SBF-SEMは近年、使用が急激に増加していますが、このイメージングモダリティの成功には、適切な組織調製やイメージングパラメータなどの技術的側面が最も重要です。このイメージングシステムは、デバイスの自動化された性質から恩恵を受け、イメージングプロセス中に顕微鏡を放置することができ、1日で何百もの画像を自動収集することができます。しかし、適切な組織製剤がなければ、細胞の超構造は、誤った結論や誤解を招く結論が導かれるような方法で変更することができます。さらに、画像は、樹脂組み込み生物学的サンプルのブロック面をスキャンすることによって生成され、これはしばしば対処しなければならない課題と考慮事項を提示します。「組織充電」と呼ばれるイメージング中のブロック内の電子の蓄積は、コントラストの喪失と細胞構造を理解できないことにつながる可能性があります。さらに、電子ビームの強度/電圧を上げたり、ビームスキャン速度を下げたりすると画像解像度が向上しますが、これはまた、樹脂ブロックを損傷し、イメージングシリーズの後続の画像を歪めるという不幸な副作用を持つことができます。ここでは、細胞の超構造を維持し、組織の充電を減少させる生体組織サンプルの調製のためのルーチンプロトコルを提示する。また、組織ブロックへのダメージを最小限に抑えた高品質のシリアル画像の迅速な取得に関する画像化に関する考慮事項も提供しています。

概要

シリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)は、1981年にレイトンによって最初に説明され、樹脂に埋め込まれた組織の薄い部分を切断して画像化できる内蔵のミクロトームで増強された走査型電子顕微鏡を作りました。残念ながら、技術的な制限は、生体組織などの非導電性サンプルが許容できないレベルの充電(組織サンプル内の電子蓄積)を蓄積したように、その使用を導電性試料に制限した。蒸発した炭素減らされたティッシュの充満で切り傷の間のブロック面をコーティングする間、この画像取得時間およびイメージ貯蔵は、当時のコンピュータ技術が装置によって作成された大きなファイルサイズを管理するのに不十分であったため、問題が残った。この方法論は、可変圧室2を搭載したSBF-SEMを用いて、2004年にデンクとホルストマンによって再検討された。これにより、サンプル内の充電を低減するイメージングチャンバに水蒸気を導入することができ、非導電性サンプルのイメージングは、画像解像度の損失とはいえ実行可能になります。組織調製法およびイメージング法のさらなる改善により、高真空を用いたイメージングが可能となり、SBF-SEMイメージングは、もはや、充電3、4、5、6、7、8、9を放散するために水蒸気に依存しなくなりました。SBF-SEMは近年、使用が急激に増加していますが、このイメージングモダリティの成功には、適切な組織調製やイメージングパラメータなどの技術的側面が最も重要です。

SBF-SEMは、3-5 nm10、11の小さな平面解像度で、何千もの連続登録電子顕微鏡画像の自動収集を可能にします。重金属を含浸させ、樹脂に埋め込まれた組織は、ダイヤモンドナイフを取り付けた超ミクロトームを含む走査型電子顕微鏡(SEM)内に配置される。平らな表面をダイヤモンドナイフで切断し、ナイフを引き込み、ブロックの表面を電子ビームでラスターパターンでスキャンして組織の超構造の画像を作成します。次に、ブロックは「z ステップ」と呼ばれる z 軸で指定された量 (例えば 100 nm) を上げ、プロセスが繰り返される前に新しいサーフェスがカットされます。このようにして、組織が切り取られると、画像の3次元(3D)ブロックが生成されます。このイメージングシステムは、デバイスの自動化された性質からさらに恩恵を受け、イメージングプロセス中に顕微鏡を放置することができ、1日で何百もの画像を自動収集することができます。

SBF-SEMイメージングは主にブロック面の画像を形成するために後方散乱電子を使用するが、二次電子は、撮像プロセス12の間に生成される。二次電子は、ブロックから逃げない後方散乱型電子や一次ビーム電子と並んで蓄積し、ブロック面に局在する静電場につながる「組織充電」を生み出す。この電子蓄積は、画像を歪めたり、ブロックから放出される電子を発生させ、後方散乱検出器によって集められた信号に寄与し、信号対雑音比13を減少させる。組織の帯電のレベルは、電子線の電圧または強度を低減させることによって減少させることができるが、またはビームのドウェル時間を短縮するが、これは減少する信号対雑音比14をもたらす。低電圧または強度の電子ビームを使用する場合、またはビームが各ピクセル空間内に短期間だけ収まる場合、組織から放出される後方散乱電子が少なく、より弱い信号をもたらす電子検出器によって捕捉される。デンクとホルストマンは、チャンバーに水蒸気を導入することによってこの問題に対処し、それによって画像解像度を犠牲にしてチャンバーとブロック面の電荷を低減した。チャンバー圧力が10-100 Paの場合、電子ビームの一部が散乱して画像ノイズや分解能の損失を起こしますが、試料室ではイオンが生成され、サンプルブロック2内の電荷が中和します。サンプルブロック内の電荷を中和する方法は、撮像中にブロック面上に窒素の焦点ガス注入を使用する、またはプローブビーム集荷エネルギーを減少させ、6、7、15を集めた信号を増加させるためにSBF-SEM段階に負の電圧を導入する。ステージバイアスを導入するのではなく、チャンバー圧力や局在窒素注入をブロック表面への電荷蓄積を低減させ、より積極的な撮像設定16を可能にする樹脂ミックスにカーボンを導入することにより樹脂の導電率を高めることも可能である。以下の一般的なプロトコルは、2010年に発表されたDeerinckら.プロトコルの適応であり、高分解能画像取得3、17、18、19を維持しながら組織の充電を最小限に抑えるために有用であるとわかった組織準備およびイメージング方法論の変更をカバーしている。前述のプロトコルは組織処理と重金属含浸に焦点を当てていますが、このプロトコルはSBF-SEM研究に固有のイメージング、データ分析、および再構築ワークフローに関する洞察を提供します。当研究室では、このプロトコルは、角膜や前部構造を含む多種多様な組織にうまく、再現的に適用されています。 まぶた、涙液および硬直腺、失明および視神経、心臓、肺および気道、腎臓、肝臓、クレマスター筋肉、および大脳皮質/髄質、およびマウス、ラット、ウサギ、モルモット、魚、単層および層状細胞培養、豚、非ヒト霊長類、ヒト20、22、23小さな変更は特定の組織やアプリケーションにとって価値があるかもしれませんが、この一般的なプロトコルは、当社のコアイメージング機能のコンテキストで非常に再現性と有用性が証明されています。

プロトコル

すべての動物は、視力および眼科研究における動物の使用に関する視覚および眼科研究の研究声明およびヒューストン大学検眼動物取り扱いガイドラインに記載されているガイドラインに従って取り扱われました。すべての動物の手順は、彼らが取り扱われた機関によって承認されました:マウス、ラット、ウサギ、モルモット、および非ヒト霊長類の手順はヒューストン大学動物ケアと使用委員会によって承認され、ゼブラフィッシュの手順はDePauuu大学動物ケアと使用委員会によって承認され、豚の手順はベイラー医科大学動物ケアと使用委員会によって承認されました。ヒト組織に関する研究に関する全てのヒト組織はヘルシンキ宣言に従って取り扱われ、適切な機関審査委員会の承認が得られた。

1. 組織処理

  1. 0.4 Mナトリウムカコチル酸ナトリウム粉末をddH2Oに混合して、0.4 Mのカコチル酸ナトリウム溶液を調製し、バッファーを十分に混合し、pH溶液を7.3に調整します。このバッファーは固定液(ステップ1.3で後述する組成物)、洗浄バッファー、オスミウムおよびフェロシアン化カリウム溶液を作るために使用される。
    注:灌流固定は、多くの場合、固定が急速に、体全体で発生するので、SBF-SEM研究のための固定の最良の方法です。スタディ設計内で灌流固定が不可能な場合は、ステップ 1.3 に進みます。
  2. 動物モデル24、25、26に適切な生理学的圧力で灌流固定を行う。これは、ヘパリン化生理食塩水と固定剤を伴う経心連続灌流を介して行われ、それぞれが生物の上の特定の高さ(例えば、100cm)(例えば、100cm)上に置かれ、固定剤が左心室に流れ込み、右心房で作られた切開部から出て出る。目的の組織は、血液が固定剤に置き換えられるにつれて青白くなり、組織のすべてまたは一部がブランシュしない場合、組織が適切に固定されず、超構造が保存されない可能性があります。
  3. カミソリの刃または鋭いメスを使用して、2 mm x 2 mm x 2 mm 以下のブロックに組織サンプルをトリミングします。ステップ1.2がスキップされた場合、組織をできるだけ早く浸漬固定できるように迅速にこれを行います。
    1. あるいは、固定液の下で組織を解剖し、浸漬プロセスを完了するために新鮮な固定剤に移す。固定液の最終組成物は、2.5%グルタルアルデヒドおよび2mM塩化カルシウムを含む0.1Mナトリウムカコジレート緩衝液から構成される。固定は最低2時間室温で、最大4°Cで一晩進みます。 可能であれば、ロッカー/チルトプレートを使用して、固定中にサンプルを静かに攪拌します。
    2. あるいは、インバータマイクロ波が利用可能な場合は、1分間、1分間の4サイクルで150ワットの真空下で前述の固定剤で組織を固定する。マイクロ波固定は、組織を迅速に固定し、組織の超構造27を保存するので、ステップ1.3の好ましい方法である。
      注:このプロトコル中に組織が乾燥することは決して許されるべきではない、注意して、ある溶液から次の溶液に迅速に組織を移す必要があります。
  4. 固定組織を2mM塩化カルシウムを含む0.1Mカコチル酸ナトリウム緩衝液中の室温で、それぞれ3分間(合計15分)洗浄します。
  5. 以下のオスミウムフェロシアン化物溶液を新鮮なものにし、前の洗浄工程中に好ましい。4%オスミウム四酸化溶液(ddH2 Oで調製)を0.2 Mカコチル酸緩衝液中の3%カリウムフェロシアン化物と4mM塩化カルシウムで等量と組み合わせます。前の洗浄ステップの後、この溶液中の組織を暗闇の中の氷の上に1時間置き、ヒュームフードに入れます。
    注:オスミウム四酸化物質は、アンプルに入って来黄色の結晶性物質です。オスミウム四酸化溶液を作成するには、アンプルを開き、ddH2Oを追加し、結晶が完全に溶解するまで暗闇の中で3〜4時間超音波処理します。オスミウム四酸化溶液は、透明黄色の溶液であり、溶液が黒である場合オスミウムは減少しており、もはや使用すべきではない。
  6. オスミウムフェロシアン化物溶液中で組織がインキュベートされている間に、チオカルボヒドラジド(TCH)溶液の調製を開始する。この溶液を新鮮に調製し、1時間オスミウムフェロシアン化物固定期間の終了時に容易に入手できるようにしてください。チオカルボヒドラジド0.1gをddH2Oの10 mLと組み合わせ、この溶液を60°Cのオーブンに1時間置きます。溶液が溶解していることを確認するために、10分ごとに静かに旋回する。使用前に、0.22 μmのシリンジフィルターを使用してこの溶液をフィルターします。
  7. TCHでインキュベートする前に、室温ddH2O 5xをそれぞれ3分間(合計15分間)洗浄します。
  8. 組織を濾過したTCH溶液に室温で合計20分間入れる(図1A-C)。
  9. TCHでインキュベーションした後、室温ddH2Oで各3分間(合計15分)の組織を5x洗浄する。
  10. 2%オスミウム四酸化(フェロシアン化カリウムで還元しないオスミウム)を室温で30分間含むddH2Oに組織を入れる。これは、ヒュームフードで、オスミウムが光によって減少することができるように暗闇の中で行われるべきです(例えば、アルミニウム箔の下で) (図1D-F)。
  11. 四酸化オスミウムインキュベーションに続き、室温ddH2Oでそれぞれ3分間(合計15分)の組織を5倍洗浄する。
  12. 組織を1%酢酸尿素水溶液(ウラニル酢酸粉末ddH2O中に混合)を冷蔵庫に一晩4°Cで入れる。
  13. 冷蔵庫からティッシュを取り出す直前に、新鮮なウォルトンの鉛アスパラギンス溶液を準備します。0.03 Mアスパラギン酸溶液(蒸留水10mLで0.04 gアスパラギン酸)の10mLに0.066gの硝酸鉛を溶解し、1N KOH(蒸留水10mLで0.5611g)でpHを5.5に調整します。
    注意: pHを調整するときに沈殿物が形成される可能性があります。これは受け入れられません。
    1. 攪拌バーを使用して、pHを監視しながら1 N KOHをゆっくりと滴下します。完成した透明な鉛アスパラギンス溶液を60°Cのオーブンで30分間予熱します。沈殿物が形成された場合、溶液は使用できず、別の溶液を準備する必要があります。
  14. 冷蔵庫から組織を取り出し、室温ddH2Oでそれぞれ3分間(合計15分)5倍洗浄する。
  15. 洗浄後、温めたウォルトンの鉛アスパラギンス溶液に組織を30分間入れ、温度を60°Cに保ちます。
  16. ウォルトンの鉛アスパラギンスでインキュベーションした後、組織を室温ddH2Oでそれぞれ3分間(合計15分)洗浄する(図1G-I)。
  17. 氷冷アセトンシリーズ(30%、50%、70%、95%、95%、100%、100%、および100%アセトン(該当する場合はddH2O)を介して組織を脱水し、シリーズの各ステップごとに10分を許容する。
  18. 氷冷脱水系列に続いて、室温アセトンに組織を10分間入れる。
    1. この間、埋め込み812 ACM樹脂を配合する。それはビーム損傷に対してより耐性であるように「ハードミックス」のレシピを使用してください。樹脂を十分に混合し、4時間埋め込み812:アセトン(1:3ミックス)に組織を入れ、続いて812:アセトン(1:1ミックス)を8時間または一晩埋め込み、最後に埋め込み812:アセトン(3:1ミックス)を一晩で埋め込みます。これらの樹脂浸透工程を室温で行います。
  19. 翌日、組織を100%Embed 812に入れ、次に新鮮な100%Embed 812で一晩、最後に新鮮な100%埋め込み812に4時間置く。これらの樹脂浸透工程を室温で行います。
    1. 埋め込む直前に、少量の樹脂を混合容器に入れ、樹脂が粉末で飽和するが、まだ液体で粒状にならないまで、カーボンブラックパウダーにゆっくりと混ぜる(木製スティックを攪拌することができます)。それは厚いインクに似ていて、目に見える塊なしで木製の棒からゆっくりと滴り落ちることができるはずです。
  20. シリコーンゴム型の組織サンプルを向け、樹脂ブロック内のサンプルの向きが記録され、参照できるように写真を撮ります。シリコンモールドの先端にカーボンブラック飽和樹脂でサンプルを覆い、65°Cで約1時間オーブンに金型を入れます。
    1. 材料を傾斜に置き、組織サンプルを覆う金型の先端に樹脂を含みます。実験/組織サンプル識別子を持つラベルを、樹脂の反対側の端にある金型に配置します(図2A)。
  21. オーブンからシリコーンモールドを取り出し、透明な樹脂(カーボンブラックなし)で金型の残りの部分を充填して、ラベルが見える状態を保つようにします。透明樹脂と容易に混ぜないほどカーボンブラックを注入した樹脂を硬化する。
    1. ティッシュを含まない型の中に余分な井戸を準備する。余分な井戸から始まり、透明な樹脂で金型の残りの部分を埋めます。
    2. カーボンブラック注入樹脂が透明樹脂にブリードし始めた場合は、シリコーンモールドをオーブンに戻して追加時間(例えば、15分)置きます。
    3. すべての組織サンプルに透明な樹脂がトッピングされたら、シリコーンモールドをオーブンに戻し(平らで、傾斜なし)65°Cで48時間硬化プロセスを完了します。

2. ブロックの準備

注: この方法は、サンプルがブロック内でどのように向き付けされているか、および断面がどのように行われるかによって異なります。しかし、最も一般的な組織の配向は、樹脂ブロックの先端に中心となる組織を見つけ、樹脂ブロックの長い端に垂直である。

  1. ほとんどの場合、まず、ブロックの端部をトリムして、標本ブロックをミクロトームチャックに入れ、テーパーエンドをチャックから約5〜6mm突き出して組織を見つけます。セットネジで所定の位置にロックし、ヒートランプの下に置きます。
  2. 数分後にブロックは可鍛性があり、簡単にトリムできます。分型顕微鏡ホルダーにチャックを置き、ティッシュが見えるまで薄いセクションをブロック面と平行にするために新しい二重刃のカミソリの刃を使用する。これは、ブロック面を横切って光を釣ることによって最もよく見られ、組織サンプルは、組織を欠いている樹脂のそれらの部分に比べて、より少ない反射および粒状になります。カーボンブラック飽和樹脂の導入前に採取した組織サンプルの写真を参考に、組織の位置と場所を知る。
  3. トリミング目的で1本の検体ピンホルダーを脇に置きます。このピンホルダーは、SEMチャンバに配置されることはありませんので、手袋なしで処理することができ、これはトリミングピンホルダーと呼ばれます。 画像の部屋に置かれる運命の標本のホールダーは手袋なしで触れられてはならない。これは顕微鏡の部屋にグリースおよびオイルを導入することを避ける。
  4. トリムピンホルダーにアルミニウム製のピンを入れ、ピンホルダーの上に3~4mm保持したピンの面(平らな面)でセットねじを少し締めます。
  5. ピンの面にいくつかの深い十字架の傷を作り、標本を所定の位置に保持するために使用される接着剤のためのより大きな表面積を提供します。アルミニウム製ピンを使用する場合は、このステップに小さなスチール製のフラットヘッドドライバーをお勧めします(図2B)。
  6. ティッシュサンプルを含むチャックをヒートランプの下に戻し、樹脂が柔らかく可鍛性になるまで置き、それを実体顕微鏡下のチャック容器に入れます。
  7. 両刃のカミソリ刃を用いて、組織試料を含む樹脂ブロックの部分から余分な樹脂を切り取る。最終的にピンに取り付けられた組織ブロックのサイズは直径約3mm、高さ2〜3mmになります。
    1. 約1〜2mmの樹脂ブロックに慎重にカミソリをまっすぐに押し込み、前のカットに等しい深さでレシンブロックに慎重に横方向に押し込みます。組織サンプルを含むブロックの部分を損傷または切り取ることができるので、ゆっくりと細心の注意を払ってこれを行います。2つのカットが合うと、余分な樹脂がブロックから分離します。3 mm x 3 mm の上がった領域が残るまで、樹脂の取り外しを続けます。
  8. この最初のトリミングの後、数分間、ヒートランプの下にブロック(チャック内に残る)を置きます。
  9. 樹脂が柔らかく可鍛性になったら、ブロックを実体顕微鏡の下に戻します。新しいダブルエッジカミソリブレードを使用して、樹脂ブロックの上部を切り落とし、トリミングされた部分の約1mm下に、単一の滑らかなカットで切断します。これは、試料のピンに接着されますので、平らな表面が好ましいです。このステップでは、ブロックの除去された部分に転送され、飛び去ることができるいくつかの力が必要となるため、サンプルが失われないように注意してください。カットとトリミングしたサンプルは脇に置きます。
  10. 切断したアルミニウムピンを含むトリミングピンホルダーを立体型レセプタクルに入れる。シアノアクリル酸接着剤の薄い層をピン面に塗布し、目に見える半月板を形成することなくピンを完全に覆います。鉗子でティッシュブロックのトリミングされた部分を拾い、ピンの面に置きます。組織サンプルを検体ピンの上に中央に置きます。押し下げて数秒間押し続けます。接着剤を数分間設定します。
  11. 接着剤が完全に乾燥したら、トリミングピンホルダーを実体顕微鏡の下に戻します。細かいファイルを使用して、余分な樹脂をファイルし、ピンに樹脂が張り出さないようにします。樹脂の形状は、円形のピンヘッドに似ているはずです。
  12. あなたの樹脂ブロックの上げられた部分のティッシュを見つける、斜めの照明はこのために有用である。二重エッジカミソリを使用して、組織サンプルを含む樹脂の隆起部分を1mm2以下の領域にトリミングする必要があります。可能であれば、ブロック面はさらに小さくトリミングすることができ、これはダイヤモンドナイフのストレスを軽減し、その長寿を改善します。
    1. できるだけ多くの余分な樹脂を取り除き、ブロックを1次元に少し長く残します。これは、あまりにも多くの力が加えられる場合に組織サンプルを含む樹脂が分解することが可能であるため、ゆっくりと注意して行われます。カミソリを推奨しますが、このステップには細かい金属ファイルを使用できます。
  13. 過剰な樹脂を細かい金属ファイルの角度で、組織試料を含む上げ部の外側の領域において、ピンの端に向かって下降する(図2C)。
  14. 銀色の塗料を塗布する前に、準備したサンプルから樹脂の粒子とほこりを取り除き、金スパッタリングを施します。銀とアセトンを混ぜて、マニキュアに似た液体(ただし、アプリケーターから滴り落ちるほど薄くない)になるようにし、サンプルブロック表面全体に薄いコートを塗ります。アセトンは急速に蒸発するので、銀色の塗料が増え始めると、アセトンを追加する必要があるかもしれません。
    1. 顕微鏡に積み込む前に、銀色の塗料を一晩乾燥させます。
      注:この銀の層は、1 mm x 1 mm を超えてブロック面を拡大しないように薄くする必要があり、銀色の塗料がダイヤモンドナイフを損傷したことがないが、ダイヤモンドナイフの寿命を維持するために、より小さなブロック面を引き続き推奨します。銀と混合したアセトンは、光学器にアセトン蒸気を導入しないように、金スパッタリングまたはサンプルを顕微鏡にロードする前に完全に蒸発する必要があります。
    2. 銀色の塗料の適用に続いて、サンプルブロックに金の薄い層を適用します。標準の金箔ターゲットを装備した標準的な真空スパッタリング装置を使用して、200ミリトール(アルゴンガス)と2分間実行する40ミリアンペアのチャンバー圧力は、20 nmの厚い金のコーティングになります。
  15. コーティング後、取り付けられたトリミングされたブロックを適切な実験ラベルを取り付けたチューブに入れてください。使い捨て可能な移動ピペットを使用してカスタムチューブを作成します。
    1. 転写ピペットを球根のすぐ下に切り、転写ピペットチューブの短い部分を球根端の下に取り付けたままにします。切り取った管状部分を短くし、ピペットチップを十分に切り戻して、アルミニウム製の標本ピンを内側にぴったりと押し込むことができます。
    2. アルミニウム製の試料ピンを含む端部を、変性転写ピペットの球根端に入れる。
  16. 準備されたティッシュブロックをロードする前に、ブロック面の表面から余分な銀色のペンキを慎重に切り取る。

3. ブロック面をイメージングするための SEM 設定

注: 以下の画像設定は、著者が使用するデバイスで作成されたもので、提供されている 資料表 に記載されています。この装置は可変的な圧力のイメージ投射が可能である間、最もよい結果は高真空の下で捕獲された。

  1. ドウェルタイム: シリアル断面の際は12μs/pxを使用してください。対象領域が特定されると、32 μs/pxで高解像度の画像を取得できます。
  2. 真空設定: 9e-008 Paの銃圧力、1.1e-004 Paの柱圧力、および9.5e-002 Paのチャンバー圧力を使用してください。
  3. キャプチャ時間: 上記の設定では、イメージあたり 50 秒のレートで 2048x2048 px のイメージ スタックをキャプチャします。対象領域の高解像度画像は、画像あたり 9 分弱で 4096x4096 px でキャプチャできます。
  4. 断面の厚さ: 100-200 nm を使用します。少ないは可能ですが、低いビーム電圧、強度、またはドウェル時間を必要とする場合があります。
  5. 高電圧(HV):7-12 kVを使用してください。電圧を大きくするとスポットサイズが小さくなり、解像度が高くなりますが、ビーム損傷の可能性が高まります。高いkVは細部の損失をもたらすビームの浸透を増加させる。しかし、kVを下げると、信号対雑音比(図3)14が低下する。
  6. ビーム強度(BI): 著者のSBF-SEM装置は1から20までの範囲のビームの強度のスケールを提供する。このスケールでは、5-7の値は、過度の充電やビーム損傷なしで品質の画像を与えます。ただし、BI の解像度が高いほど、充電やビームダメージ14が発生する可能性が高くなります。
  7. スポットサイズと画像倍率: ビーム強度と電圧レベルでスポットサイズを決定します。スポット サイズは、使用するピクセル サイズよりも大きくならないのが理想的です。ピクセル サイズは、視野 (FOV) をピクセル数で割ることによって決まります。たとえば、25 μm の FOV の画像サイズが 2048x2048 ピクセルの場合、ピクセルあたり 12.2 nm になります。したがって、スポット サイズは 12.2 nm 以下にする必要があります。 図4 は、HV、BI、スポットサイズがどのように関連しているかを示しています。
  8. 作動距離(WD) - ブロック面イメージングでは、作業距離は調整できません。それは単に焦点の要因です。これは、イメージ化されたすべてのブロックでほぼ同一になります。作動距離は調整できませんが、キャプチャした画像の解像度において重要な役割を果たします。作業距離が短くなるほど、キャプチャした画像の解像度制限が大きくなります。場合によっては、イメージングチャンバー内で変更を行うことで作業距離を短くすることができる場合もありますが、これらの変更はユーザーの裁量で行う必要があります。作業距離を短くして画像解像度を高めるために、ドアマウントミクロトームネジを緩め、ネジを締め直した後、ビーム検出器に約2mm近く置くようにミクロトームを再配置しました。
  9. 解像度 - 上記の設定を使用して、3.8 nmの高いxとyの解像度が可能です。解像度は、ビームスポットサイズと画像キャプチャのピクセル解像度によって制限されることに注意することが重要です(例えば、2048x2048ピクセル画像で撮影された20μmの視野は、3.8nmのスポットサイズを使用した場合でも、ピクセル解像度は9.8nmです)。z平面における画像解像度は断面厚さに依存しており、100-200 nmはこのプロトコルでうまく機能することがわかります。

結果

マウスコルネア
このプロトコルは、マウス角膜に広く適用されています。SBF-SEMイメージングを用いて、エラスチンフリーマイクロフィブリル束(EFMB)のネットワークが成体マウス角膜内に存在することが示された。以前は、このネットワークは胚性および出生後早期の発達中にのみ存在すると考えられていました。SBF-SEMは角膜全体に広範なEFMBネットワークを明らかにし、断面?...

ディスカッション

この方法論文の目的は、当社の研究室が高解像度のシリアル電子顕微鏡画像を確実にキャプチャすることを可能にした組織調製法とイメージング方法論を強調し、この結果につながる重要なステップと、SBF-SEMイメージングを行う際に起こり得る潜在的な落とし穴を指摘することです。このプロトコルを使用して成功するには、組織の適切な固定、サンプルへの重金属の含浸、充填樹脂の改質...

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

サム・ハンロン博士、エブリン・ブラウン博士、マーガレット・ゴンド博士の優れた技術支援に感謝します。この研究は、国立衛生研究所(NIH)R01 EY-018239およびP30 EY007551(国立眼科研究所)の一部、一部はライオン視覚財団、一部はNIH 1R15 HD084262-01(国立小児保健人間開発研究所)によって支えられました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1/16 x 3/8 Aluminum RivetsIndustrial Rivet & Fastener Co.6N37RFLAP/1100Used as specimen pins.
2.5mm Flathead ScrewdriverWiha Quality Tools27225
AcetoneElectron Microscopy SciencesRT 10000Used to dilute silver paint.
Aspartic AcidSigma-AldrichA8949
Calcium ChlorideFisherScientificC79-500
Conductive Silver PaintTed Pella16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil targetDenton VacuumN/AThis is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged RazorsFisher Scientific50-949-411
Embed 812Electron Microscopy Sciences14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEMGatan & TescanN/AThis is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)Electron Microscopy Sciences72630-05
GluteraldehydeElectron Microscopy Sciences16320
Gorilla Super Glue - Impact ToughNANARefered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen BlackHM RoyalEC-600JDRefered to as carbon black in text.
KOHFisherScientific18-605-593
Lead NitrateFisher ScientificL62-100
MicrowavePelcoBioWave ProThis is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium TetroxideSigma-Aldrich201030
Potassium FerrocyanideSigma-AldrichP9387
Silicone Embedding MoldTed Pella10504
Sodium Cacodylate TrihydrateElectron Microscopy Sciences12300
Samco Transfer PipetteThermoFisher Scientific202Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle FilesElectron Microscopy Sciences62115
ThiocarbohydrazideSigma-Aldrich223220
Uranyl AcetatePolysciences, Inc.21447-25
Reconstruction Software
Amira SoftwareThermo ScientificN/AUsed to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ)ImageJ.netN/ATrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB)University of Helsinki, Institute of BiotechnologyN/A
Reconstuct SoftwareNeural Systems LabN/A
SuRVoS WorkbenchDiamond Light Source & The University of NottinghamN/A
SyGlassIstoVisio, Inc.N/AAllows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.

参考文献

  1. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
  2. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLOS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  3. He, Q., Hsueh, M., Zhang, G., Joy, D. C., Leapman, R. D. Biological serial block face scanning electron microscopy at improved z-resolution based on Monte Carlo model. Scientific Reports. 8 (1), 12985 (2018).
  4. Zankel, A., Wagner, J., Poelt, P. Serial sectioning methods for 3D investigations in materials science. Micron. 62, 66-78 (2014).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43 (5), 612-620 (2012).
  7. Bouwer, J. C., et al. Deceleration of probe beam by stage bias potential improves resolution of serial block-face scanning electron microscopic images. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2 (1), 11 (2017).
  8. Kizilyaprak, C., Longo, G., Daraspe, J., Humbel, B. M. Investigation of resins suitable for the preparation of biological sample for 3-D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 189 (2), 135-146 (2015).
  9. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  10. Biazik, J., Vihinen, H., Anwar, T., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. The versatile electron microscope: an ultrastructural overview of autophagy. Methods. 75, 44-53 (2015).
  11. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  12. Piňos, J., Mikmeková, &. #. 3. 5. 2. ;., Frank, L. About the information depth of backscattered electron imaging. Journal of Microscopy. 266 (3), 335-342 (2017).
  13. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
  14. Goggin, P., et al. Development of protocols for the first serial block-face scanning electron microscopy (SBF SEM) studies of bone tissue. Bone. 131, 115107 (2020).
  15. Deerinck, T. J., et al. High-performance serial block-face SEM of nonconductive biological samples enabled by focal gas injection-based charge compensation. Journal of Microscopy. 270 (2), 142-149 (2018).
  16. Nguyen, H. B., et al. Conductive resins improve charging and resolution of acquired images in electron microscopic volume imaging. Scientific Reports. 6, 23721 (2016).
  17. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. National Center for Microscopy and Imaging Research. 6 (8), (2010).
  18. Deerinck, T. J., et al. Enhancing Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Enable High Resolution 3-D Nanohistology of Cells and Tissues. Microscopy and Microanalysis. 16, 1138-1139 (2010).
  19. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  20. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy: A provocative technique to define 3-dimensional ultrastructure of microvascular thrombosis. Thrombosis Research. 196, 519-522 (2020).
  21. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy reveals neuronal-epithelial cell fusion in the mouse cornea. PLoS One. 14 (11), 0224434 (2019).
  22. Lafontant, P. J., et al. Cardiac Myocyte Diversity and a Fibroblast Network in the Junctional Region of the Zebrafish Heart Revealed by Transmission and Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. PLoS One. 8 (8), 72388 (2013).
  23. Hanlon, S. D., Behzad, A. R., Sakai, L. Y., Burns, A. R. Corneal stroma microfibrils. Experimental Eye Research. 132, 198-207 (2015).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  25. Davenport, A. T., Grant, K. A., Szeliga, K. T., Friedman, D. P., Daunais, J. B. Standardized method for the harvest of nonhuman primate tissue optimized for multiple modes of analyses. Cell Tissue Bank. 15 (1), 99-110 (2014).
  26. Schuster, A., et al. An isolated perfused pig heart model for the development, validation and translation of novel cardiovascular magnetic resonance techniques. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 12 (1), 53 (2010).
  27. Hanlon, S. D., Patel, N. B., Burns, A. R. Assessment of postnatal corneal development in the C57BL/6 mouse using spectral domain optical coherence tomography and microwave-assisted histology. Experimental Eye Research. 93 (4), 363-370 (2011).
  28. Longiéras, N., Sebban, M., Palmas, P., Rivaton, A., Gardette, J. L. Multiscale approach to investigate the radiochemical degradation of epoxy resins under high-energy electron-beam irradiation. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 44 (2), 865-887 (2006).
  29. Hashimoto, T., Thompson, G. E., Zhou, X., Withers, P. J. 3D imaging by serial block face scanning electron microscopy for materials science using ultramicrotomy. Ultramicroscopy. 163, 6-18 (2016).
  30. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: A novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801 (2009).
  31. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  32. Katoh, K. Microwave-Assisted Tissue Preparation for Rapid Fixation, Decalcification, Antigen Retrieval, Cryosectioning, and Immunostaining. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2016, 7076910 (2016).
  33. Login, G. R., Dvorak, A. M. A review of rapid microwave fixation technology: its expanding niche in morphologic studies. Scanning. 15 (2), 58-66 (1993).
  34. Jamur, M. C., Faraco, C. D., Lunardi, L. O., Siraganian, R. P., Oliver, C. Microwave fixation improves antigenicity of glutaraldehyde-sensitive antigens while preserving ultrastructural detail. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 307-311 (1995).
  35. Leong, A. S., Sormunen, R. T. Microwave procedures for electron microscopy and resin-embedded sections. Micron. 29 (5), 397-409 (1998).
  36. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  37. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  38. Belazi, D., Solé-Domènech, S., Johansson, B., Schalling, M., Sjövall, P. Chemical analysis of osmium tetroxide staining in adipose tissue using imaging ToF-SIMS. Histochemistry and Cell Biology. 132 (1), 105-115 (2009).
  39. Rivlin, P. K., Raymond, P. A. Use of osmium tetroxide-potassium ferricyanide in reconstructing cells from serial ultrathin sections. Journal of Neuroscience Methods. 20 (1), 23-33 (1987).
  40. Aguas, A. P. The use of osmium tetroxide-potassium ferrocyanide as an extracellular tracer in electron microscopy. Stain Technology. 57 (2), 69-73 (1982).
  41. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  42. Watson, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. II. Application of solutions containing lead and barium. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 4 (6), 727-730 (1958).
  43. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy. Scanning Microscopy in Nanotechnology. , 1-40 (2006).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Buchacker, T., et al. Assessment of the Alveolar Capillary Network in the Postnatal Mouse Lung in 3D Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Frontiers in Physiology. 10, 1357 (2019).
  46. Keeling, E., et al. 3D-Reconstructed Retinal Pigment Epithelial Cells Provide Insights into the Anatomy of the Outer Retina. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), (2020).
  47. Shang, P., et al. Chronic Alcohol Exposure Induces Aberrant Mitochondrial Morphology and Inhibits Respiratory Capacity in the Medial Prefrontal Cortex of Mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 561173 (2020).
  48. Pfeifer, C. R., et al. Quantitative analysis of mouse pancreatic islet architecture by serial block-face SEM. Journal of Structural Biology. 189 (1), 44-52 (2015).
  49. Wilke, S. A., et al. Deconstructing complexity: serial block-face electron microscopic analysis of the hippocampal mossy fiber synapse. Journal of Neuroscience. 33 (2), 507-522 (2013).
  50. Cocks, E., Taggart, M., Rind, F. C., White, K. A guide to analysis and reconstruction of serial block face scanning electron microscopy data. Journal of Microscopy. 270 (2), 217-234 (2018).
  51. Borrett, S., Hughes, L. Reporting methods for processing and analysis of data from serial block face scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 263 (1), 3-9 (2016).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  54. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).
  55. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality Head-mounted displays. arXiv . , (2018).
  56. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
  57. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  58. Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198 (1), 43-53 (2017).
  59. Anderson, H. R., Stitt, A. W., Gardiner, T. A., Archer, D. B. Estimation of the surface area and volume of the retinal capillary basement membrane using the stereologic method of vertical sections. Analytical & Quantitative Cytology & Histology. 16 (4), 253-260 (1994).
  60. Gibbons, C. H., Illigens, B. M., Wang, N., Freeman, R. Quantification of sweat gland innervation: a clinical-pathologic correlation. Neurology. 72 (17), 1479-1486 (2009).
  61. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec. 292 (1), 113-122 (2009).
  62. Mahon, G. J., et al. Chloroquine causes lysosomal dysfunction in neural retina and RPE: implications for retinopathy. Current Eye Research. 28 (4), 277-284 (2004).
  63. Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. Journal of Microscopy. 150, 117-136 (1988).
  64. Weibel, E. R. Stereological methods in cell biology: where are we--where are we going. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (9), 1043-1052 (1981).
  65. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  66. Kristiansen, S. L., Nyengaard, J. R. Digital stereology in neuropathology. Apmis. 120 (4), 327-340 (2012).
  67. Howard, C. V., Reed, M. G. . Unbiased Stereology. 2nd edn. , (2005).
  68. Reith, A., Mayhew, T. M. . Stereology and Morphometry in Electron Microscopy: Problems and Solutions. , (1988).
  69. Mouton, P. R. . Principles and practices of unbiased stereology: an introduction for bioscientists. , (2002).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

169SBF SEM3D EM3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved