Bu araştırma Bill & Melinda Gates Vakfı (OPP1113682) ve Bill & Melinda Gates Vakfı (OPP1211043) ile İnsan Sistemleri İmmünoloji Merkezi tarafından finansal olarak desteklendi. C.M.M. Stanford Lisansüstü Bursu ve Stanford Bio-X William ve Lynda Steere Bursu tarafından desteklendi. A.K.G. Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu ve Stanford Fen ve Mühendislik Lisansüstü Bursu Gabilan Bursu için minnettardır. S.C., Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından F32CA247352 Ödül Numarası altında desteklendi. Yazarlar ayrıca Dr. Gillie Roth, Dr. Anthony Yu, Dr. Lyndsay Stapleton, Dr. Hector Lopez Hernandez, Dr. Andrea d'Aquino, Dr. Julie Baillet, Celine Liong, Ben Ou, Emily Meany, Emily Gale ve Dr. Anton Smith gibi Appel Lab üyelerini, Appel Lab'ın bu protokolleri geliştirmesine yardımcı olma çabaları ve zamanları için sıcak bir şekilde kabul etmek istiyor.

Bu yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Polimer-Nanopartikül (PNP) hidrojelleri kolayca imal edilir ve terapötik hücrelerin ve ilaçların doğrudan enjeksiyon veya kateter teslimatı yoluyla minimal invaziv uygulama yoluyla uzun süreli yerel olarak teslim edilmesini sağlar. Bu protokoller PNP hidrojellerinin formülasyonunu ve elde eden malzemelerin kalitesini güvence altına alma için karakterizasyon yöntemlerini açıklar. Supramoleküler PNP hidrojeller üretilebilir ve modifiye selüloz polimerleri ve polimerik çekirdek kabuklu nanopartiküllerin basit bir şekilde karıştırılmasıyla oluşur. Bu yöntemler, basit dirsek karıştırma protokolleri aracılığıyla şırıngamlara önceden yüklenmiş jeller oluşturmak için facile prosedürlerini açıklar. NP boyutunu ve dağıtımını izlemek için DLS gibi bileşen parçalarının her birinin kalite kontrol ölçümleri sayesinde, tutarlı reolojik özelliklere sahip PNP hidrojel malzemeleri yeniden formüle edilebilir. HPMC-C12 veya NP miktarını değiştirerek, elde edilen PNP hidrojelinin ağ boyutunu ve sertliğini modüle edebilirsiniz. Bu özellikler belirli bir biyomedikal uygulamaya en uygun şekilde ayarlanabilir ve burada ayrıntılı olarak açıklanan reolojik yöntemlerle araştırmacılar, platformu özel uygulamaları için optimize ettikleri için PNP hidrojellerinin kesme inceltme ve kendi kendini iyileştirme özelliklerini karakterize edebilir. Tüp bebek salınım çalışmaları için yöntemler de açıklanmıştır; araştırmacılar bu çalışmaları, gelecekteki in vivo çalışmaları bilgilendirerek, ilgi çekici ilaçların serbest bırakılmasının göreceli zaman ölçeğini karakterize etmek için kullanabilirler. Araştırmacılar, stabilite çalışmalarını kullanarak, biyoterapötiklerin soğuk zincir bağımlılığını azaltmak için zorlayıcı potansiyel uygulamalarla, hassas biyoterapötiklerin biyolojik yapısını ve stabilitesini zaman içinde ve aşırı sıcaklıklarda korumaya yardımcı olmak için bu malzemelerin yeteneğini de değerlendirebilirler. Son olarak, basit hücre canlılığı tahlilleri ile hücre büyümesi ve PNP malzemeleri içindeki göç, hücre tedavileri ve iskelelerdeki potansiyel uygulamalarla değerlendirilebilir.
Grubumuz PNP hidrojel platformu27için birçok zorlayıcı uygulama buldu. PNP hidrojelleri, antijenlerin ve yardımcıların eşleşen kinetik salınım profillerinin humoral immün yanıtın büyüklüğünü, süresini ve kalitesini artırmak için mümkün olan alt ünvan aşılarının yavaş teslimi için kullanılmıştır31. PNP hidrojellerinin en sık kullanılan hidrojellerden daha küçük bir ağ boyutuna sahip olduğu bulunmuştur, bu nedenle difüzyonu yavaşlatmada ve moleküler yükü yavaşça serbest bırakmada etkilidirler. PNP hidrojellerin benzersiz doku yapışma özellikleri ve mekanik özellikleri, hidrojellerin ameliyattan sonra organların geniş yüzey alanlarına püskürtülerek ameliyattan kaynaklanan yapışıklıkları önlemek için fiziksel bariyerler oluşturmak için de kullanılmıştır30. PNP hidrojellerinin de etkili hücre dağıtım araçları olduğu gösterilmiştir ve mekanik özellikler aslında enjeksiyon sırasında şırınga iğnesinde meydana gelen mekanik kuvvetlerden hücreleri korur, hücre canlılığını artırır29. NP'ler bir hücre yapışkan peptidi ile eşlendiğinde, hücreler uygulanabilir kalmak için PNP matrisini takabilir ve bunlarla etkileşime girebilir. Bu yaklaşımı kullanarak, PNP hidrojellerinin sıvı araçları kullanan yöntemlere kıyasla enjekte edilen kök hücrelerin lokal tutulmasını iyileştirdiği gösterilmiştir28. Ek olarak, PNP hidrojellerinin, sert stresli yaşlanma koşullarında bile kapsüllenmiş insülinin termal olarak indüklenen toplanmasını önlediği gösterilmiştir, bu da bu malzemelerin sıcaklığa duyarlı ilaçları soğutma ihtiyacını azaltabileceğini düşündürmektedir38.
Genel olarak, burada açıklanan metodolojiler, araştırma gruplarının PNP hidrojellerini biyomalzeme olarak üretip keşfetmelerine izin verecektir. Bu protokoller, hem in vitro hem de in vivo çalışmaları sürdürmek için yeterli hidrojel malzemeyi imal etmek için laboratuvar ölçeğinde sentez teknikleri sağlar. Yukarıda açıklanan çalışmalar, bu malzemelerin dinamik çapraz bağlantılarının, moleküler kargonun pasif difüzyonunu kısıtlarken, tuzaklı hücrelerin aktif hareketliliğine izin vererek bir dizi biyomedikal uygulama için uygun olmasını sağladığını göstermektedir. Araştırmacıların PNP platformunu kontrollü ilaç dağıtımı yoluyla klinik sonuçları iyileştirmek ve hücre alımı ve mekanobiyoloji gibi temel biyolojik mekanizmaları incelemek için erişilebilir ve güçlü bir araç bulmaları bekmektedir.

Enjekte edilebilir hidrojeller, terapötik hücreleri ve ilaçları kontrollü bir şekilde vücuda ulaştırmak için ortaya çıkan bir araçtır1. Bu malzemeler ilaçlar veya hücrelerle yüklenebilir ve yüzeysel dokulara doğrudan enjeksiyon veya derin dokulara kateter teslimatı ile minimal invaziv bir şekilde uygulanabilir. Genel olarak, enjekte edilebilir hidrojeller, geçici, fiziksel etkileşimlerle birbirine birbirine kenemiş su şişmiş polimer ağlarından oluşur. Dinlenme sırasında, bu çapraz bağlantılar jellere katı benzeri bir yapı sağlar, ancak yeterli mekanik kuvvetin uygulanması üzerine bu çapraz bağlantılar geçici olarak bozulur ve malzeme kolayca akabilen sıvı benzeri bir duruma dönüşür2. Fiziksel hidrojellerin kesmesine ve enjeksiyon sırasında küçük iğne çaplarından akmasına izin veren bu reolojiközelliklerdir 3. Enjeksiyondan sonra, malzemenin polimer ağı, kendi kendini iyileştirmesine ve hızla katı benzeri bir jel oluşturmasına izin verir4,5. Bu yapılar, doku yenilenmesi için ilaçlar veya iskeleler için yavaş salınım depoları olarak işlev görür6,7. Bu malzemeler ilaç dağıtım teknolojisi, rejeneratif tıp ve immünomühendislik 1,8 , 9 ,10,11,12'yikapsayan çeşitli uygulamalarda kullanılmıştır.
Hem doğal malzemeler (örneğin, aljinat ve kollajen) hem de sentetik malzemeler (örneğin, poli(etilen glikol) (PEG) veya benzeri hidrofilik polimerler) biyouyumlu enjekte edilebilir hidrojel malzemeler olarak geliştirilmiştir13,14,15. Birçok doğal malzeme, tekrarlanabilirliği etkileyen toplu iş varyasyonu sergiler4,16. Bu malzemeler genellikle fizyolojik sıcaklıklara ulaştıktan sonra iyileşen sıcaklığa duyarlıdır; bu nedenle, bu malzemelerin işlenmesi ek teknik ve lojistik zorluklar doğurur17. Sentetik malzemeler daha hassas kimyasal kontrol ve mükemmel tekrarlanabilirlik sağlar, ancak bu malzemeler bazen biyouyumlarını sınırlayan olumsuz bağışıklık yanıtlarına maruz kalabilir, bu da in vivo terapötik uygulamalar için kritik birözelliktir 6,18,19. Son çabalar, enjekte edilebilir bir hidrojel malzemenin mühendisliğinde mekanik özelliklerin optimize edilmesi, polimer ağ örgü boyutu, biyoaktif moleküler ipuçları, biyobozunurluk ve malzemenin immünojenikliği 20 , 21 , 22 ,23,24,25,26dahil olmak üzere birçok karmaşık tasarım kriteri olduğunu göstermiştir. Tüm bu faktörler, ilginin uygulanmasına bağlı olarak düşünülmelidir, bu da modüler, kimyasal olarak ayarlanabilir bir platformun geniş bir uygulama genişliğini karşılamak için ideal olduğu anlamına gelir.
Mevcut yöntemler, ayarlanabilir mekanik özellikler, yüksek derecede biyouyumluluk ve düşük immünojeniklik sergileyen enjekte edilebilir bir polimer-nanopartikül (PNP) hidrojel platformunun formülasyonunu ve kullanımını açıklar ve biyoaktif moleküler ipuçları 27 ,28 ,29,30,31,32,33'üçağrıştırmak için siteler sunar. Bu PNP hidrojeller hidrofobik modifiye selüloz polimerleri ve bir supramoleküler ağ üretmek için etkileşime giren poli (etilen glikol)-blok-poli (laktik asit) (PEG-PLA)27,34'den oluşan kendi kendine monte edilmiş çekirdek kabuklu nanopartiküllerden oluşur. Daha spesifik olarak, dodecyl modifiye hidroksipropimetil selüloz polimerleri (HPMC-C12),PEG-PLA nanopartiküllerinin yüzeyi ile dinamik olarak etkileşime girer ve bu polimer ağını oluşturmak için bu nanopartiküller arasındaki köprü27,34. Bu dinamik, çok değerli etkileşimler, malzemelerin enjeksiyon sırasında kesmesine ve uygulamadan sonra hızla kendini iyileştirmesine izin verir. PNP hidrojel bileşenleri basit tek pot reaksiyonları ile kolayca imal edilir ve PNP hidrojel, iki bileşenin basit bir şekilde karıştırılmasıyla hafif koşullar altında oluşturulur35. İmalat kolaylığı nedeniyle, bu hidrojel platformu ölçek olarak son derece çevrilebilir. PNP hidrojellerinin mekanik özellikleri ve ağ boyutu, formülasyondaki polimer ve nanopartikül bileşenlerinin ağırlık yüzdesi değiştirilerek kontrol edilir. Bu platform ile yapılan önceki çalışmalar, PNP hidrojellerinin son derece biyouyumlu, biyobozunur ve immünojenik olmayan28,30,31olduğunu göstermektedir. Genel olarak, bu hidrojeller ameliyat sonrası yapışıklık önleme, doku mühendisliği ve rejenerasyon, sürekli ilaç dağıtımı ve immünörineringi kapsayan biyomedikal uygulamalarda geniş fayda sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305165</td>
			<td>PNP hydrogel injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G, 4 in hypodermic needles</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>N224</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates, black, clear bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3540</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, black</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-627</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, clear</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8729K66</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>NP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR759015-100EA</td>
			<td>Cell viability and settling studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Plate Reader</td>
			<td>Wyatt Technology</td>
			<td>DynaPro II Plate Reader</td>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>300007-392 (EA)</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>8300015027</td>
			<td>In vitro release studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer elbow connector</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-30800-12</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer lock syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-456</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>PNP hydrogel formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Spatula</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1229F13</td>
			<td>Rheological characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Reader</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate seals</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>TS-RT2-100</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11382II</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheometer</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>DHR-2 Rheometer</td>
			<td>Rheological characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3516-5G</td>
			<td>Biostability studies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels for cell and drug delivery applications

Bu yöntemler, biyomalzeme olarak kullanılmak üzere enjekte edilebilir, supramoleküler polimer-nanopartikül (PNP) hidrojellerin nasıl formüle edilerek kullanılacağı açıklanmaktadır. PNP hidrojelleri iki bileşenden oluşur: ağ polimeri olarak hidrofobik olarak modifiye selüloz ve dinamik, çok değerli etkileşimler yoluyla kovalent olmayan çapraz bağlayıcılar olarak hareket eden kendi kendine monte edilmiş çekirdek kabuk nanopartikülleri. Bu yöntemler, hem nano-prekipitasyon yoluyla kendi kendine monte edilen bu nanopartiküllerin oluşumunu hem de ayarlanabilir mekanik özelliklere sahip hidrojeller oluşturmak için iki bileşenin formülasyonunu ve karıştırılmasını açıklar. Sentezlenen malzemelerin kalitesini karakterize etmek için dinamik ışık saçılım (DLS) ve reoloji kullanımı da ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Son olarak, bu hidrojellerin ilaç dağıtımı, biyofarmasötik stabilizasyon ve hücre kapsülleme ve doğumu için faydası, ilaç salınımını, termal stabiliteyi ve hücre yerleştirme ve canlılığını karakterize etmek için in vitro deneylerle gösterilmiştir. Biyouyumluluğu, enjekte edilebilirliği ve hafif jel oluşum koşulları nedeniyle, bu hidrojel sistemi bir dizi biyomedikal uygulama için uygun kolayca tonlanabilir bir platformdur.

PNP hidrojel imalatı ve karakterizasyonu PNP hidrojelleri iki ana bileşenin karıştırılmasıyla oluşur - hidrofobik olarak modifiye edilmiş HPMC polimerleri ve PEG-PLA nanopartikülleri (Şekil 1a). Terapötik kargo, hidrojel hazırlamadan önce nanopartikül bileşenini seyreltmek için kullanılan ek tampona kolayca dahil edilir. Aşağı akış biyomedikal karakterizasyon için, iki bileşenin basit ve tekrarlanabilir karıştırılmasını sağlayan bir dirsek karıştırma yöntemi kullanmak uygundur (Şekil 1b). Yeterli karıştırmadan sonra, hidrojel şırıngada sıkı hissetmeli, ancak basınç altında verim vermeli ve standart bir iğneden ekstrüze etmelidir (gösterilen 21G) (Şekil 1c). Enjeksiyondan sonra, hidrojel hızla yerçekiminden gelen akışa direnen katı benzeri bir malzemeye ayarlanmalıdır. Hidrojel'i tam olarak karakterize etmek ve tutarlı toplu ürünler sağlamak için, numuneler bir reometre üzerinde birkaç farklı deney kullanılarak analiz edilmelidir. Jelin kesme inceltme ve kendi kendini iyileştirme yetenekleri, sırasıyla bir akış süpürme protokolü ve adım kesme protokolü kullanılarak kolayca gözlemlenecektir (Şekil 2a,b). 2:10 formülasyonu gibi daha sert jeller için, kullanıcı, kesme oranı enjeksiyon sırasında mekanik koşulları simüle eden 0,1'den 100 s -1'e yükseltildikçe akış süpürme sırasında en az iki büyüklük sırasını azaltmak için viskozite aramalıdır. Adım kesme protokolü, yüksek kesme adımları altında viskozitede büyüklükte bir azalma ve düşük kesme adımları sırasında taban çizgisi viskozitesine hızlı bir dönüş (<5 s kurtarma süresi) göstermelidir. Doğrusal viskoelastik rejimde salınımlı kesme frekansı süpürme deneyi kullanılarak depolama ve kayıp modülünün karakterizasyonu, 0,1-100 rad s-1 (Şekil 2c)frekans aralıklarında katı benzeri özellikleri ortaya çıkaracaktır. Özellikle, genellikle 2:10 hidrojeller gibi daha sert formülasyonlar için düşük frekanslarda gözlemlenebilen kesme depolama ve kayıp modülünün bir geçişi olmamalıdır. Böyle bir çapraz olay, değiştirilmiş HPMC veya PEG-PLA polimerinin başlangıç malzemelerinin kalitesindeki sorunları veya PEG-PLA nanopartiküllerinin boyutunu ve dağılımını gösterebilir. 1:5 hidrojel gibi daha zayıf hidrojel formülasyonları için bir geçit olayının beklenebileceği belirtilmelidir. PNP hidrojellerdeki salınımlı kesme genliği süpürmeleri, malzemelerin yüksek stres değerleri uygulanana kadar verim vermediğini ortaya koymaktadır, bu da bu malzemelerin bir verim stresine, malzemenin akması için gereken bir eşik stres miktarına sahip olduğunu gösterir.
PNP hidrojellerinden salınım kinetiğini karakterize etme İlaç teslimatı için PNP jelleri tasarlamanın önemli bir adımı, ilaç salınım kinetiğinin seçilen bir formülasyondan tanımlanmasıdır. Bunun için birkaç teknik vardır, ancak basit bir in vitro metodoloji erken formülasyon geliştirme sırasında yararlı veriler sağlar (Şekil 3a). HPMC-C12 veya NP miktarını modüle ederek PNP hidrojellerinin polimer içeriğini değiştirmek, bu hidrojellerin mekanik özelliklerini ve ağ boyutunu ayarlamanın en basit yoludur, bu da polimer ağı üzerinden kargonun yayılması ve malzemelerden salınma oranı üzerinde doğrudan bir etkiye sahip olabilir (Şekil 3b). Dinamik ağ boyutundan (yani yüksek moleküler ağırlık veya büyük hidrodinamik yarıçap) daha büyük olan kargolar için araştırmacılar, hidrojel deposundan kargonun yavaş, çözünme aracılı bir şekilde serbest bırakılmasını beklemelidir. Kargo boyutundan büyük veya buna eşit dinamik ağ boyutlarına sahip formülasyonlar, geleneksel kargo difüzyon modelleri kullanılarak tanımlanabilecek difüzyon aracılı serbest bırakma ve46 , 47,48,49serbest bırakma için izin verecektir. Serbest bırakma eğrisinin şekline bağlı olarak, araştırmacılar hidrojel'i daha yavaş (örneğin, polimer içeriğini artırın) veya daha hızlı (örneğin, polimer içeriğini azaltın) serbest bırakmaya ayarlamak için yeniden biçimlendirebilirler.
Terapötik kargonun stabilitesinin değerlendirilmesi Bir hidrojel formülasyonunda terapötik yükün stabilitesinin belirlenmesi, klinik öncesi veya hücresel çalışmalara başlamadan önce kritik öneme sahiptir. İlaçları kapsüllemek için diğer sentetik yöntemlerle karşılaştırıldığında, PNP hidrojelleri dökme malzemeye karıştırarak kargoyu nazik bir şekilde içerir ve kapsüllemenin kargoya zarar verme olasılığı düşüktür. Bu çalışmalar, PNP hidrojellerinin ayrıca insülin gibi termal kararsızlığa duyarlı, raf ömrünü önemli ölçüde uzatan ve soğuk depolama ve dağıtıma olan güveni azaltan yükü stabilize edebileceğini göstermektedir (Şekil 4). Yükün durumunun hidrojel içine kapsüllendikten hemen sonra ve uzun depolama sürelerinden sonra değerlendirilmesi önemlidir. Bu veriler, insülin toplamayı ölçmek için basit bir floresan tahlili kullanarak, sürekli termal ve mekanik stres altında 28 günlük depolamadan sonra insülinin hidrojellerde sabit kaldığını göstermektedir. Uygun bir plaka testinin yapılamadığı durumlar için alternatif bir teknik, özellikle protein ilaçlarının ikincil yapısını belirlemek için yararlı olan kargonun dairesel dikroizm ölçümlerini yapmak olacaktır.
PNP hidrojellerinde hücre canlılığının ve dağılımının belirlenmesi Birçok terapötik hücrenin canlı kalması için yapışma motifleri gerekir ve bu nedenle arginin-glisine-aspartik asit (RGD) peptitleri gibi integrin motiflerinin dahil edilmesi, PNP hidrojellerinin hücresel tedavilere uyarlanması için önemli bir adımdır50. NP'lerden oluşan modüler PEG-PLA polimer, peg koronanın basit "tıklama" kimyaları28,51ile kimyasal işlevselleştirilmesini sağlar. Bu örnekte, PNP hidrojel yapısı ile hücre etkileşimini teşvik etmek için PEG-PLA polimerine hücre yapışkanlı RGD peptitler tutturuldu. Kapsüllenmiş hücreler bu yapışıklık motifleri ile formülasyonlarda kapsüllenmiş hücrelere kıyasla çoğalamadığı için yapışıklık bölgelerinden yoksun formülasyonlar düşük hücre canlılığına sahip olacaktır (Şekil 5a,b). Kapsüllenmiş hücreler, floresan mikroskopla hücre sayımını kolaylaştırmak için kalsein veya başka bir uygun floresan boya (örneğin CFSE) ile etiketlenebilir. Optimizasyon sırasında, integrin fonksiyonel formülasyonlarının gelişmiş canlılık ve çoğalma sağladığına emin olmak için uygulanabilirlik değiştirilmemiş PNP hidrojelleri ile karşılaştırılmalıdır. Integrin fonksiyonelleştirilmiş formülasyonlar değiştirilmemiş hidrojellerle benzer etkinlik sağlıyorsa, bu yapışma motiflerini dahil etmek için kullanılan konjugasyon kimyasında bir arızaya işaret edebilir.
Araştırmacılar, uygun bir hidrojel formülasyonu kullanırken kapsüllenmiş hücrelerin hidrojel ortamına eşit olarak dağılmasını beklemelidir. Bu, hidrojel yönetimi sırasında hücrelerin tutarlı ve öngörülebilir bir şekilde dosing edilmesine izin verecektir ve uygulamadan sonra hidrojeldeki hücrelerin lokal tutulmasına çevrilmelidir. Floresan mikroskopi teknikleri kullanılarak hücrelerin dağılımı kolayca belirlenebilir. Hücreler uygun bir boya ile etiketlenebilir ve daha sonra konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenebilir. Görüntüler görsel olarak değerlendirilebilir (Şekil 5c) ve ayrıca imageJ yazılımı kullanılarak görüntünün dikey ekseni boyunca ortalama floresan yoğunluğunu ölçmek için (veya yerçekimi nedeniyle hangi eksende hücre yerleştirme olması bekleniyorsa) nicel olarak (Şekil 5d). Hidrojel formülasyonu, uzun zaman dilimleri boyunca süspansiyondaki hücreleri desteklemek için çok zayıfsa, Şekil 5'teki1:1 formülasyonunda gözlemlendiği gibi hücre yerleştirme meydana gelecektir. Polimer içeriğinin artırılması, yerleşmeye bağlı olarak inhomogeneöz hücre dağılımı ile ilgili sorunları çözebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig1v4.jpg"> Şekil 1: Polimer-nanopartikül (PNP) hidrojelleri iki bileşen karıştırılarak kolayca oluşturulur. (a) İlk bileşen dodecyl modifiye hidroksipropimetil selüloz çözeltisi (HPMC-C12),ikinci bileşen ise herhangi bir terapötik kargo ile birlikte poli (etilen glikol)-blok-poli(laktik asit) (PEG-PLA) nanopartiküllerinin bir çözeltisidir. Bu iki bileşenin nazik bir şekilde karıştırılması, HPMC-C12 polimerlerinin PEG-PLA nanopartikülleri ile dinamik, çok değerli etkileşimlerle fiziksel olarak birbirine bağlı olduğu enjekte edilebilir bir hidrojel sağlar. (b) Her biri PNP hidrojelinin bir bileşenini içeren iki şırınna ile karıştırılarak jel formülasyonunun gösterildiği fotoğraf. İki şırınnayı bir Luer-lock dirsek konektörü ile bağlayarak, iki bileşen steril koşullar altında kolayca karıştırılarak, anında kullanım için bir şırıncaya önceden yüklenmiş kabarcıksız bir hidrojel elde edilebilir. NP çözümü gösteri amacıyla maviye boyanır. (c) PNP hidrojellerinin enjeksiyonunun ve yeniden katılaşmasının gösterimi. (i) PNP hidrojel bağlı bir şırınga içinde 21G iğne. (ii) Enjeksiyon, hidrojelleri polimer ve nanopartiküller arasındaki etkileşimleri geçici olarak bozan kesmenin altına yerleştirir ve sıvı benzeri bir kıvam oluşturur. (iii) Enjeksiyon sonrası, dinamik polimer-nanopartikül etkileşimleri hızla reform yaparak hidrojelin kendi kendine iyileşmesine izin verir. (iv) Katı hidrojel, yerçekimi gibi verim stresinden daha zayıf kuvvetler altında akmaz. PNP hidrojel gösteri amacıyla maviye boyanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig2v3.jpg"> Şekil 2: İki PNP hidrojel formülasyonunun reolojik karakterizasyonu. Formülasyonlar polimer wt.%: NP wt.%olarak gösterilir. (a)Sabit kesme akışı, PNP hidrojellerinin düşükten yüksek kesme hızına kadar süpürülür. Kesme hızının bir fonksiyonu olarak viskozite, kesme inceltme özelliklerini karakterize eder. (b)PNP hidrojellerinin kendi kendini iyileştiren özelliklerini gösteren düşük kesme hızları (beyaz arka plan; 0,1 s−1)ile yüksek kesme hızları (kırmızı arka plan; 10 s−1)arasındaki kesme hızlarını salınma işlevinin viskozitesi. Kesme oranları her biri 30 s için uygulanır. (c) Elastik depolama modülü G′ ve viskoz kayıp modülü G" çeşitli PNP hidrojel formülasyonları için sabit bir% 1 suşta frekans fonksiyonu olarak. (d) Genlik, PNP hidrojellerinin elastik depolama modülü G′ ve viskoz kayıp modülü G" yi stresin bir fonksiyonu olarak karakterize etmek için 10 rad / s sabit bir frekansta süpürür. Bu reolojik karakterizasyon, kalite kontrolü için karşılaştırma olarak kullanılabilir. Bu rakam Grosskopf ve ark.28'den<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig2v2large.jpg" target="_blank"></a> uyarlanmıştır.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2.jpg"> Şekil 3: PNP hidrojellerinden sığır serum albüminin (BSA) in vitro salınımı. Formülasyonlar polimer wt.%: NP wt.%olarak gösterilir. (a)Deneysel in vitro salınım protokolünü açıklayan şematik. Aliquots zamanla PNP hidrojel yüklü kılcal borulardan çıkarılır. (b) BSA'nın 1:10 PNP, 2:5 PNP ve 2:10 PNP'den in vitro salınımı, belirtilen zaman noktası tarafından toplanan kütlenin test sırasında toplanan toplam kütleye bölünmesi olarak rapor edilir (SD'± ortalama olarak gösterilen veriler; n = 3). Absorbans ölçümleri ile BSA tespit edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2.jpg"> Şekil 4: PNP hidrojellerinde kapsüllenen insülinin termal stabilitesi ThT tahlili ile. Formülasyonlar polimer wt.%: NP wt.%olarak gösterilir. Hem 1:5 hem de 2:10 PNP hidrojelde kapsüllenen insülin, 37 °C'lik stresli yaşlanma koşullarında ve sürekli ajitasyonda 28 günden fazla bir süre boyunca kontrolsüz kaldı. PBS'de formüle edilen insülin toplama süresi 20 ± 4 saatti (ortalama ± SD, toplama eşiği 750.000 AFU). Ortalama olarak sunulan veriler n = 4 deneysel kopya (AFU, keyfi floresan birimleri). Bu rakam Meis ve ark.38'den<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig4v2large.jpg" target="_blank"></a> uyarlanmıştır.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2.jpg"> Şekil 5: PNP hidrojellerinde hücre canlılığı ve hücre yerleşimi. (a,b) PNP hidrojellerinde insan mezenkimal kök hücreli hücre canlılığı çalışmaları (hMSC'ler). (a)PEG-PLA NP'lerine konjuge edilen hücre yapışkan arginin-glisine-aspartik asit (RGD) motifi ile 1:5 PNP hidrojellerde uygulanabilir hMSC'lerin temsili görüntüleri konfokal görüntülemeden önce 30 dakika boyunca kalsenin lekeliydi. Ölçek çubuğu 100 μm'yi temsil eder. (b) 6. günde hücre canlılığı, 1. günde floresan hücre sayısına göre görüntüdeki floresan hücre sayısı olarak tanımlanır (veriler SD ± ortalama olarak gösterilir; n = 3). (c,d) HMSC'lerle hücre kapsülleme ve yerleştirme deneyleri. (c) Hücre yerleşimini ölçmek için 4 saat boyunca 1:1 PNP hidrojel (üst sıra) ve 1:5 PNP hidrojel (alt sıra) kapsüllenmiş kalsenin lekeli hMSC'lerin maksimum yoğunluklu görüntüleri. Ölçek çubuğu 1 mm' dir. (d) Hidrojelin dikey profili boyunca hMSC'lerin ortalama yatay piksel yoğunluğunu temsil eder. Bu rakam Grosskopf ve ark.28'den<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62234/62234fig5v2large.jpg" target="_blank"></a> uyarlanmıştır.

Watch this Scientific Journal Video about Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications at JoVE.com

Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications

Bu protokol enjekte edilebilir, supramoleküler polimer-nanopartikül (PNP) hidrojel biyomalzemelerin sentezini ve formülasyonlarını açıklar. Bu malzemelerin ilaç dağıtımı, biyofarmasötik stabilizasyon ve hücre kapsülleme ve teslimi için uygulamaları gösterilmiştir.

Hücre ve İlaç Dağıtım Uygulamaları için Enjekte Edilebilir Supramoleküler Polimer-Nanopartikül Hidrojelleri

These methods describe how to formulate injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogels for&#160;use as biomaterials. PNP hydrogels are ...

Protokolümüz polimer-nanopartikül hidrojellerin biyomalzeme olarak kullanılmasını kolaylaştırır. Araştırmacıların bu materyali çeviri uygulamaları ve temel biyolojik soruları araştırmak için geliştireceğini umuyoruz. PNP hidrojelleri küçük çaplı iğneler ve kateterler aracılığıyla kolayca enjekte edilir, ancak enjeksiyondan sonra hızlı bir şekilde kendiliğinden iyileşir.Bu, ilaçların ve hücrelerin uzun zaman ölçeklerinde invaziv olmayan kontrollü teslimatına izin verir. Bu teknoloji, kanserden doku yenilenmesine ve pasif bağışıklamaya kadar geniş öfkeli koşulların etkileri ile lokalize tedavi ve genişletilmiş ilaç salınımı için sınırları zorlar. Nano parçacıkları nano çökeltme ile sentezlemek için, sekiz mililitrelik cam scintillation şişesine 50 miligram PEG-PLA polimer ekleyin ve şişeye bir mililitre asetonitril ekleyin.Girdap tamamen çözülecek. Daha sonra küçük bir karıştırma çubuğu ile 20 mililitrelik cam scintillation şişesine 10 mililitre ultra saf su ekleyin ve şişeyi dakikada 600 devire ayarlanmış bir karıştırma plakasına yerleştirin. Su şişesine damla yönünde polimer çözücü çözeltisinin bir mililitresini eklemek için 200 mikrolitre pipet kullanın.Polimer çözücü çözeltisi hızla suya dağıldığı için çekirdek kabuklu nanopartiküller oluşacaktır. Standart protokollere göre dinamik ışık saçılımı ile parçacık boyutunu doğrulayın. Daha sonra nano parçacık çözeltisini bir santrifüj filtre ünitesine aktarın ve çözeltiyi 250 mikrolitreden daha az birine konsantre edin ve nanopartikülleri uygun bir tamponda yeniden depoleyin.Hidrojel hazırlamak için, bir mililitre Luer kilit şırıngasına 333 miligram%6 HPMC-C12 stok çözeltisi ekleyin ve sekiz mililitrelik şişeye %20 nanopartikül stok çözeltisinin 500 mikrolitresini ve 167 mikrolitre PBS'yi ekleyin. Karıştırdıktan sonra, bir mililitre luer kilit şırıngasını seyreltilmiş nano parçacık çözeltisi ile doldurmak için bir iğne kullanın ve iki şırıngayı bir dirsek mikserine takın. Homojen, opak beyaz bir hidrojel malzeme oluşana kadar iki çözeltiyi yaklaşık 60 döngü boyunca karıştırın.Formüle edilmiş hidrojenin reolojik özelliklerini ölçmek için, seçilen geometri boşluğuna göre uygun hidrojel hacmini tırtıklı bir reometre plakasının ortasına enjekte edin ve numunenin mekanik özelliklerini ölçmek için osilatör ve akış testlerini kullanın. Hidrojelden ilaç salınımını karakterize etmek için, önce, her tüpün bir ucunun mühürlenilmesi için epoksi kullanarak bir cam kılcal damar hazırlayın. Epoksi ayarlandığında, numune başına en az üç tüpe 100 ila 200 mikrolitre hidrojel enjekte etmek için dört inç 22 kalibrelik bir hipodermik iğne kullanın ve her bir hidrojel hacmine dikkatlice 200 ila 300 mikrolitre PBS ekleyin.Uygun zaman noktalarında, beklenen ilaç salınımı zaman ölçeğine göre, PBS'yi hidrojel yüzeyi bozmadan her kılcal damardan dikkatlice çıkarmak ve taze bir PBS hacmi eklemek için bir iğne kullanın. Çalışmanın tamamlanmasıyla, toplanan PBS aliquotlarını her zaman noktasında salınan ilaç miktarını ölçmek için uygun bir yöntemle analiz edin. Jel kapsüllenmiş insülinin termal stabilitesini karakterize etmek için, gösterildiği gibi hidrojele hem insülin hem de thioflavin T yükleyin ve 200 mikrolitre yükü enjekte etmek için 21 kalibrelik bir iğne kullanın ve numune başına en az üç siyah 96 kuyu plakası kuyusuna hidrojel yükleyin.Daha sonra buharlaşmayı önlemek için plakayı optik olarak netleştirilmiş yapışkan plaka contası ile kapatın ve plakayı sıcaklık kontrolü, sallama ve kinetik okuma programlama ile donatılmış bir plaka okuyucusuna yerleştirin. Hidrojel kapsüllenmiş hücre canlılığını değerlendirmek için, numune başına üç kuyunun her birine uygun hücre konsantrasyonu içeren 150 mikrolitre hidrojel enjekte etmek için 21 kalibrelik bir iğne kullanın ve her bir hidrojel hacmine uygun hücre ortamının 100 mikrolitresini ekleyin. Kültürün ilk gününde, her bir hidrojel üzerindeki süpernatantı her örnek grubu için uygun zaman noktasında iki milimoler Calcein çözeltisinin 50 mikrolitresi ile değiştirin.30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, konfokal mikroskopi ile her kuyunun merkezini görüntüleyin. Kapsüllenmiş hücrelerin enjeksiyondan önce bir şırıngaya yerleşme yeteneğini değerlendirmek için, ilgi çekici hücreleri PBS konsantrasyonunda mililitre başına altı hücreye bir kez 10'a seyreltin ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca iki milimoler Kalsein AM'nin 50 mikrolitresi ile lekeleyin. Kuluçkanın sonunda, hücreleri gösterildiği gibi 500 ila 700 mikrolitre hidrojel ile karıştırın ve örnek başına en az bir cuvette'in dibine hidrojel içeren 100 ila 200 mikrolitre hücre enjekte etmek için 21 kalibrelik bir iğne kullanın.Daha sonra cuvettes enjeksiyondan hemen sonra ve tohumlamadan hemen sonra bir ve dört saat sonra hücrelerin hidrojel içine yerleşip yerleşmediğini veya askıya alınıp alınmadığını gözlemlemek için konfokal mikroskop sahnesinde yanlarında düz yatan cuvetteleri görüntüleyin. Jelin kesme inceltme ve kendi kendini iyileştirme yetenekleri, sırasıyla akış süpürme ve adım kesme protokolleri kullanılarak gözlemlenebilir. Saniyede 0,1 ila 100 radyan frekans aralığında doğrusal viskoelastik rejimde salınımlı kesme frekansı süpürme deneyi kullanılarak depolama ve kayıp modülerinin karakterizasyonu katı benzeri özellikleri ortaya koymaktadır.Genellikle daha sert formülasyonlar için düşük frekanslarda gözlenen kesme depolama ve kayıp modülünün bir geçişi olmamalıdır, ancak daha zayıf bir hidrojel formülasyonları için çaprazlama olayları beklenebilir. PNP hidrojellerinin polimer içeriğinin değişmesi, kargonun polimer ağı üzerinden yayılması ve malzemelerden salınma oranı üzerinde doğrudan bir etkiye sahip olabilir. PNP hidrojelleri ayrıca termal kararsızlığa duyarlı kargoyu stabilize edebilir, kargo raf ömrünü önemli ölçüde uzatabilir ve soğuk zincir depolama ve dağıtımına olan güveni azaltabilir.Integrin motiflerinin dahil edilmesi, PNP hidrojellerinin hücresel tedaviler için uyarlaması için yararlı olabilir. Kapsüllenmiş hücreler, görselleştirmelerini ve nicelemelerini kolaylaştırmak için floresan olarak etiketlenebilir. Örneğin, yapışıklık bölgelerinden yoksun formülasyonlar, kapsüllenmiş hücreler kapsüllenmiş hücrelere ve RGD gibi yapışıklık motiflerine sahip formülasyonlara kıyasla çoğalamadığı için düşük hücre canlılığına sahip olacaktır.Formülasyondaki değişikliklerin polimer matrisinin reolojik özelliklerini ve dinamik örgüsünü nasıl etkilediğini hala araştırıyoruz. Ayrıca hidrojel içindeki moleküllerin difüzyonunu incelemek için FRAP kullanıyoruz. Bu malzemeler, sürekli doğumun ilaç dağıtımını, aşı geliştirmeyi veya kanser immünoterapisini nasıl etkileyebileceği hakkında yeni biyolojik sorular sormak için kullanılabilir.

Hücre ve İlaç Dağıtım Uygulamaları için Enjekte Edilebilir Supramoleküler Polimer-Nanopartikül Hidrojelleri

Abstract