ניתוח קריו-EM וחלקיקים בודדים עם Scipion

Summary

ניתוח חלקיקים בודדים במיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית היא אחת הטכניקות העיקריות המשמשות לקביעת מבנה ההרכבים הביולוגיים ברזולוציה גבוהה. Scipion מספקת את הכלים ליצירת הצינור כולו לעיבוד המידע שנרכש על ידי המיקרוסקופ ולהשיג שחזור תלת מימדי של הדגימה הביולוגית.

Abstract

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית הפכה לאחד הכלים החשובים ביותר במחקר ביולוגי כדי לחשוף את המידע המבני של מקרומולקולים ברזולוציה כמעט אטומית. בניתוח חלקיקים בודדים, המדגם המהולל הוא בתמונה על ידי קרן אלקטרונים ואת הגלאים בסוף עמוד המיקרוסקופ לייצר סרטים של מדגם זה. סרטים אלה מכילים אלפי תמונות של חלקיקים זהים באוריינטציות אקראיות. הנתונים צריכים לעבור דרך זרימת עבודה של עיבוד תמונה עם שלבים מרובים כדי להשיג את אמצעי האחסון המשוחזר של תלת-ממד הסופי. המטרה של זרימת העבודה של עיבוד תמונה היא לזהות את פרמטרי הרכישה כדי להיות מסוגל לשחזר את הדגימה תחת מחקר. Scipion מספקת את כל הכלים ליצירת זרימת עבודה זו באמצעות מספר חבילות עיבוד תמונה במסגרת אינטגרטיבית, המאפשרות גם את המעקב אחר התוצאות. במאמר זה כל זרימת העבודה עיבוד תמונה ב Scipion מוצג ונדון עם נתונים המגיעים ממקרה בדיקה אמיתי, נותן את כל הפרטים הדרושים כדי לעבור מהסרטים המתקבלים על ידי המיקרוסקופ לשחזור תלת-ממדי סופי ברזולוציה גבוהה. כמו כן, העוצמה של שימוש בכלי קונצנזוס המאפשרים שילוב שיטות, ואישור תוצאות לאורך כל שלב של זרימת העבודה, שיפור הדיוק של התוצאות שהושגו, נדון.

Introduction

במיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryo-EM), ניתוח חלקיקים יחיד (SPA) של דגימות מיובשות קפואות הוא אחד הווריאנטים הנפוצים והמצליחים ביותר של הדמיה עבור מקרומולקולות ביולוגיות, שכן הוא מאפשר להבין אינטראקציות מולקולריות ואת הפונקציה של הרכבים ^{ביולוגיים1}. זאת הודות להתקדמות האחרונה בטכניקת הדמיה זו שהולידה את "מהפכת הרזולוציה" ² ואפשרה קביעה מוצלחת של מבנים תלת-ממדיים ביולוגיים ברזולוציה כמעט אטומית. נכון לעכשיו, הרזולוציה הגבוהה ביותר שהושגה בספא cryo-EM היה 1.15 Å עבור apoferritin3 (ערך EMDB: 11668). התפתחויות טכנולוגיות אלה כוללות שיפורים בהכנת ^המדגם4, ברכישת ^{התמונה5} ובשיטות עיבוד ^{התמונה6}. מאמר זה מתמקד בנקודה אחרונה זו.

בקצרה, המטרה של שיטות עיבוד התמונה היא לזהות את כל הפרמטרים הרכישה כדי הפוך את תהליך ההדמיה של המיקרוסקופ ולשחזר את המבנה 3D של הדגימה הביולוגית תחת המחקר. פרמטרים אלה הם הרווח של המצלמה, התנועה הנגרמת על ידי קרן, הסטיות של המיקרוסקופ (בעיקר defocus), הכיוון הזוויתי התלת-ממדי ותרגום של כל חלקיק, ואת המצב הקונפורמציה במקרה של דגימה עם שינויים קונפורמיים. עם זאת, מספר הפרמטרים גבוה מאוד ו- cryo-EM דורש שימוש בתמונות במינון נמוך כדי למנוע נזק לקרינה, מה שמפחית באופן משמעותי את יחס האות לרעש (SNR) של התמונות שנרכשו. לכן, לא ניתן לפתור את הבעיה באופן חד משמעי וכל הפרמטרים שיש לחשב בלבד יכולים להיות הערכות. לאורך זרימת העבודה של עיבוד התמונה, יש לזהות את הפרמטרים הנכונים, תוך מחיקת הפרמטרים הנותרים כדי להשיג סוף סוף שחזור תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה.

הנתונים הנוצרים על ידי המיקרוסקופ נאספים במסגרות. בפישוט, מסגרת מכילה את מספר האלקטרונים שהגיעו למיקום מסוים (פיקסל) בתמונה, בכל פעם שנעשה שימוש בגלאי ספירת אלקטרונים. בשדה ראייה מסוים, נאספים מספר מסגרות וזה נקרא סרט. כמו מינונים אלקטרונים נמוכים משמשים כדי למנוע נזק קרינה שיכול להרוס את המדגם, SNR הוא נמוך מאוד ואת המסגרות המתאימות לאותו סרט צריך להיות ממוצע כדי לקבל תמונה חושפת מידע מבני על המדגם. עם זאת, לא רק ממוצע פשוט מוחל, המדגם יכול לסבול משמרות וסוגים אחרים של תנועות במהלך זמן ההדמיה בשל התנועה המושרה קרן כי צריך לפצות. המסגרות בפיצוי משמרת וממוצע מקורן במיקרוגרף.

לאחר קבלת המיקרוגרפים, עלינו להעריך את הסטיות שהוצגו על ידי המיקרוסקופ עבור כל אחת מהן, הנקראת פונקציית העברת ניגודיות (CTF), המייצגת את השינויים בניגוד למיקרוגרף כפונקציה של תדירות. לאחר מכן, ניתן לבחור ולחלץ את החלקיקים, הנקראים קטיף חלקיקים. כל חלקיק צריך להיות תמונה קטנה המכילה רק עותק אחד של הדגימה הנחקרת. ישנן שלוש משפחות של אלגוריתמים לקטיף חלקיקים: 1) אלה שמשתמשים רק בפרמטריזציה בסיסית כלשהי של מראה החלקיק כדי למצוא אותם בכל קבוצת המיקרוגרפים (למשל, גודל החלקיקים), 2) אלה שלומדים כיצד נראים החלקיקים מהמשתמש או מערכה מאומנת מראש, ו -3) אלה המשתמשים בתבניות תמונה. לכל משפחה יש מאפיינים שונים שיוצגו מאוחר יותר.

קבוצת החלקיקים המופקת שנמצאת במיקרוגרפים תשמש בתהליך סיווג דו-ממדי בעל שתי מטרות: 1) ניקוי קבוצת החלקיקים על ידי השלכת קבוצת המשנה המכילה תמונות רעש טהורות, חלקיקים חופפים או חפצים אחרים, ו-2) החלקיקים הממוצעים המייצגים כל מחלקה יכולים לשמש כמידע ראשוני לחישוב נפח ראשוני תלת-ממדי.

חישוב אמצעי האחסון ההתחלתי של 3D הוא השלב המכריע הבא. הבעיה של השגת המבנה 3D ניתן לראות כבעיית אופטימיזציה בנוף פתרון רב ממדי, שבו המינימום הגלובלי הוא אמצעי האחסון 3D הטוב ביותר המייצג את המבנה המקורי, אבל כמה minima מקומי המייצג פתרונות תת-אופטימליים ניתן למצוא, ואיפה זה מאוד קל להילכד. אמצעי האחסון ההתחלתי מייצג את נקודת ההתחלה של תהליך החיפוש, כך שהערכה ראשונית שגויה של נפח יכולה למנוע מאיתנו למצוא את המינימום הכללי. מהנפח הראשוני, שלב סיווג תלת-ממדי יעזור לגלות מצבים קונפורמיים שונים ולנקות שוב את מערכת החלקיקים; המטרה היא להשיג אוכלוסייה הומוגנית מבחינה מבנית של חלקיקים. לאחר מכן, שלב עידון תלת-ממדי יהיה אחראי על עידון הפרמטרים הזוויתיים והתרגום עבור כל חלקיק כדי לקבל את נפח 3D הטוב ביותר האפשרי.

לבסוף, בשלבים האחרונים, ניתן לחדד ולצחצח את שחזור תלת-ממד שהושג. חידוד הוא תהליך של הגברת התדרים הגבוהים של הנפח המשוחזר, והליטוש הוא צעד כדי לחדד עוד יותר כמה פרמטרים, כמו CTF או פיצוי תנועה הנגרמת על ידי קרן, ברמה של חלקיקים. כמו כן, ניתן להשתמש בהליכי אימות מסוימים כדי להבין טוב יותר את הרזולוציה שהושגה בסוף זרימת העבודה.

לאחר כל השלבים הללו, תהליכי האיתור ^{והעגינה7} יסייעו לתת משמעות ביולוגית לשחזור תלת-ממדי המתקבל, על ידי בניית מודלים אטומיים דה נובו או התאמת מודלים קיימים. אם ברזולוציה גבוהה מושגת, תהליכים אלה יגידו לנו את עמדות המבנים הביולוגיים, אפילו של האטומים השונים, במבנה שלנו.

^Scipion8 מאפשר ליצור את כל זרימת העבודה המשלבת את חבילות עיבוד התמונה הרלוונטיות ביותר באופן אינטגרטיבי. ^Xmipp9, Relion10, CryoSPARC11, ^Eman12, ^Spider13, ^Cryolo14, Ctffind15, CCP416, ^Phenix17 וחבילות רבות נוספות ניתן לכלול ב- Scipion. כמו כן, הוא משלב את כל הכלים הדרושים לטובת השילוב, יכולת שיתוף, עקיבות ויכולת רבייה כדי לבצע מעקב מלא אחר כל זרימת העבודה של עיבוד ^{התמונה8}.

אחד הכלים החזקים ביותר כי Scipion מאפשר לנו להשתמש הוא הקונצנזוס, כלומר להשוות את התוצאות שהושגו עם כמה שיטות בשלב אחד של העיבוד, מה שהופך שילוב של המידע המועבר על ידי שיטות שונות כדי ליצור פלט מדויק יותר. זה יכול לעזור לשפר את הביצועים ולשפר את האיכות שהושגה בפרמטרים המשוערים. שים לב שניתן לבנות זרימת עבודה פשוטה יותר ללא שימוש בשיטות קונצנזוס; עם זאת, ראינו את העוצמה של כלי ^זה22,25 ואת זרימת העבודה המוצגת בכתב יד זה ישתמש בו במספר שלבים.

כל השלבים שסוכמו בפסקאות הקודמות יותבררו בפירוט בסעיף הבא וישולבו בזרימת עבודה מלאה באמצעות Scipion. כמו כן, יוצגו כיצד להשתמש בכלי הקונצנזוס כדי להשיג הסכם גבוה יותר בתפוקות שנוצרו. לכך נבחרה ערכת הנתונים לדוגמה של פלסמודיום פאלסיפארום 80S ריבוזום (ערך EMPIAR: 10028, ערך EMDB: 2660). ערכת הנתונים נוצרת על ידי 600 סרטים של 16 מסגרות בגודל 4096x4096 פיקסלים בגודל פיקסלים בגודל פיקסלים של 1.34Å שצולם ב- FEI POLARA 300 עם מצלמת FEI FALCON II, עם רזולוציה מדווחת ב- EMDB היא ^3.2Å18 .

Protocol

1. יצירת פרויקט ב-Scipion וייבוא הנתונים

1. פתח את Scipion ולחץ על צור פרוייקט, ציין את שם הפרוייקט ואת המיקום שבו הוא יישמר (איור 1 משלים). Scipion תפתח את חלון הפרוייקט המציג בד ציור עם, בצד שמאל, חלונית עם רשימה של שיטות זמינות, כל אחת מהן מייצגת כלי עיבוד תמונה אחד שניתן להשתמש בו לניהול נתונים.
   הערה: ניתן להשתמש ב - Ctrl+F כדי למצוא שיטה אם היא אינה מופיעה ברשימה.
2. כדי לייבא את הסרטים שצולמו על-ידי המיקרוסקופ, בחר את ה- pwem - יבא סרטים בחלונית הימנית (או הקלד אותו בעת הקשה על Ctrl+F).
3. ייפתח חלון חדש (איור 2 משלים). שם, כלול את הנתיב לנתונים ואת פרמטרי הרכישה. בדוגמה זו, השתמש בהגדרה הבאה: מתח מיקרוסקופ 300 kV, סטייה כדורית 2.0 מ"מ, משרעת ניגודיות 0.1, קצב הגדלה 50000, מצב קצב דגימה ל - From תמונה וגודל פיקסל 1.34 Å. כאשר כל הפרמטרים בטופס מתמלאים, לחץ על לחצן בצע .
   הערה: כאשר פעולת שירות מופעלת, מופיעה תיבה בבד הציור בצבע צהוב המסומן כפעולה. כאשר פעולת שירות מסתיימת, התיבה משתנה לירוק והתווית משתנה לסיום. במקרה של שגיאה במהלך ביצוע פעולת שירות, התיבה תופיע באדום, המסומנת ככשל. במקרה זה, בדוק את החלק התחתון של בד הציור, בכרטיסיה יומן פלט יופיע הסבר על השגיאה.
4. כאשר פעולת השירות מסתיימת, בדוק את התוצאות בחלק התחתון של בד הציור בכרטיסיה סיכום . כאן, הפלטים שנוצרו על ידי השיטה מוצגים, במקרה זה, את ערכת הסרטים. לחץ על לחצן נתח תוצאות וחלון חדש יופיע עם רשימת הסרטים.

2. יישור סרט: מסרטים למיקרוגרפים

1. השתמש בשיטה xmipp3 - יישור אופטי המיישם זרימה ^{אופטית19}. השתמש בפרמטרים הבאים כדי למלא את הטופס (איור 3 משלים): סרטי הקלט הם אלה המתקבלים בשלב 1, הטווח במסגרות ליישר הוא מ- 2 עד 13, האפשרויות האחרות נשארות עם ערכי ברירת המחדל. בצע את התוכנית.
   הערה: יש למלא תמיד את הפרמטרים באותיות מודגשות בטופס. לאחרים יהיה ערך ברירת מחדל או שלא יידרשו בחובה. בחלק העליון של חלון הטופס, ניתן למצוא את השדות שבהם מופצים המשאבים החישוביים, כחילות משנה, קבצי MPIs או GPUs.
2. לחץ על ניתוח תוצאות כדי לבדוק את המיקרוגרפים המתקבלים ואת מסלול המשמרות המשוערות (איור 1). עבור כל מיקרוגרף שנראה: להסתכל על צפיפות הספקטרלי כוח (PSD), המסלולים המתקבלים כדי ליישר את הסרט (נקודה אחת למסגרת) בקואורדינטות קרטזיות וקוטביות, ואת שם הקובץ של המיקרוגרף המתקבל (לחיצה עליו, המיקרוגרף ניתן לבדוק). שים לב כי החלקיקים של הדגימה נראים הרבה יותר במיקרוגרף, בהשוואה למסגרת אחת של הסרט.

3. הערכת CTF: חישוב הסטיות של המיקרוסקופ

1. ראשית, השתמש בשיטה גריגוריאפפלאב - ctffind15. ההתקנה היא: מיקרוגרפים קלט הם הפלט של שלב 2, גורם הדגימה הידנית CTF מוגדר 1.5, וטווח הרזולוציה עובר מ- 0.06 ל- 0.42. יתר על כן, באפשרויות מתקדם (שניתן למצוא על-ידי בחירה באפשרות זו ברמת המומחה של הטופס), הגדר את גודל החלון ל- 256. הפרמטרים הנותרים נשארים עם ערכי ברירת המחדל (איור 4 משלים).
   הערה: ברוב השיטות ב- Scipion האפשרות מתקדם מציגה פרמטרי תצורה נוספים. השתמש באפשרויות אלה בזהירות, כאשר התוכנית להיות מופעל ידוע לחלוטין ואת המשמעות של הפרמטרים מובן. פרמטרים מסוימים יכולים להיות קשים למילוי מבלי להסתכל על הנתונים; במקרה כזה, Scipion מציג שרביט קסמים בצד ימין שיציג חלון אשף (איור 5 משלים). לדוגמה, בשדה פתרון טופס זה שימושי במיוחד, מכיוון שיש לבחור ערכים אלה כדי לכסות את האזור בערך מהאפס הראשון לטבעת המורגשת האחרונה של PSD.
2. לחץ על ביצוע ועל ניתוח תוצאות (איור 2) כאשר פעולת השירות מסתיימת. בדוק כי CTF המשוער תואם עם אחד ניסיוני. לשם כך, להסתכל PSD ולהשוות את הטבעות המשוערות בפינה עם אלה שמגיעים מהנתונים. בדוק גם את ערכי הפירוק שהושגו כדי למצוא ערכים בלתי צפויים וניתן למחוק או לחשב מחדש מיקרוגרפים בהתאמה. בדוגמה זו, ניתן להשתמש בכל מערך המיקרוגרפים.
   הערה: השתמש בלחצנים בחלק התחתון של החלון כדי ליצור קבוצת משנה של מיקרוגרפים (עם לחצן אדום Micrographs ) ולחשב מחדש CTF (עם חישוב מחדש של לחצן אדום CTFs ), במקרה הצורך.
3. כדי למקד את ההערכה הקודמת, השתמש בהערכה xmipp3 - ctf ²⁰. בחר כמיקרוגרף קלט את הפלט של שלב 2, בחר באפשרות השתמש בדפוצי מהערכת CTF קודמת, כאשר הערכת CTF קודמת בחרה את הפלט של grigoriefflab - ctffind, וברמה המתקדמת, שנה את גודל החלון ל- 256 (איור משלים 6). תריץ את זה.
4. לחץ על ניתוח תוצאות כדי לבדוק את CTFs שהושגו. בשיטה זו, נתונים נוספים מוערכים ומיוצגות בעמודות נוספות מסוימות. מכיוון שאף אחד מהם אינו מציג ערכים משוערים שגויים, כל המיקרוגרפים ישמשו בשלבים הבאים.

4. קטיף חלקיקים: מציאת חלקיקים במיקרוגרפים

1. לפני תחילת הקטיף, בצע קדם הפעלה של המיקרוגרפים. פתח xmipp3 - מיקרוגרפים של מעבדים מראש, הגדר כמיקרוגרף קלט אלה שהושגו בשלב 2 ובחר את האפשרויות הסר פיקסלים פגומים? עם מרובים של Stddev ל- 5, ומיקרוגרפים Downsample? עם גורם דגימת הפחתה של 2 (איור משלים 7). לחץ על בצע ובדוק שגודל המיקרוגרפים המתקבלים צומצם.
2. לשימוש לקטיף xmipp3 - בחירה ידנית (שלב 1) ו - xmipp3 - בחירה אוטומטית (שלב 2)²¹. הקטיף הידני מאפשר להכין באופן ידני קבוצה של חלקיקים שבהם שלב הקטיף האוטומטי ילמד ויפיק את הסט המלא של החלקיקים. ראשית, הפעל xmipp3 - בחירה ידנית (שלב 1) עם מיקרוגרפים קלט כמו מיקרוגרפים שהושגו קדם קדם. לחץ על בצע וחלון אינטראקטיבי חדש יופיע (איור 3).
3. בחלון זה מוצגת רשימה של המיקרוגרפים (איור 3a) ואפשרויות אחרות. שנה גודל (px) ל- 150, זה יהיה גודל התיבה המכילה כל חלקיק. המיקרוגרף שנבחר מופיע בחלון גדול יותר. בחרו אזור ובחרו בו את כל החלקיקים הנראים לעין (איור 3b). לאחר מכן, לחץ על הפעל הדרכה כדי להתחיל את הלמידה. האזורים הנותרים של המיקרוגרף נאספים באופן אוטומטי (איור 3c). בדוק את החלקיקים שנבחרו ולכלול יותר על ידי לחיצה על זה, או להסיר את אלה השגויים עם shift + לחיצה, במידת הצורך.
4. בחר את המיקרוגרף הבא בחלון הראשון. המיקרוגרף ייבחר באופן אוטומטי. בדוק שוב כדי לכלול או להסיר כמה חלקיקים, במידת הצורך. חזור על שלב זה עם, בערך, 5 מיקרוגרפים כדי ליצור ערכת הדרכה מייצגת.
5. לאחר שזה נעשה, לחץ על קואורדינטות בחלון הראשי כדי לשמור את הקואורדינטות של כל החלקיקים שנבחרו. מערך האימון של החלקיקים מוכן ללכת לקטיף האוטומטי כדי להשלים את התהליך עבור כל המיקרוגרפים.
6. פתוח xmipp3 - בחירה אוטומטית (שלב 2) המציין ב- Xmipp לקטיף חלקיקים להפעיל את הקטיף הידני הקודם, ו Micrographs לבחור כמו בפיקוח. לחץ על ביצוע. שיטה זו תפיק כפלט קבוצה של כ- 100000 קואורדינטות.
7. החל גישה קונצנזוס, כך לבצע שיטת קטיף שנייה כדי לבחור את החלקיקים שבהם שתי השיטות מסכימות. פתח sphire - cryolo לקטוף14 ולבחור את המיקרוגרפים מעובדים מראש כמו מיקרוגרף קלט, להשתמש במודל כללי? כדי כן, עם סף ביטחון של 0.3, וגודל תיבה של 150 (איור 8 משלים). תריץ את זה. שיטה זו צריכה ליצור גם סביב 100000 קואורדינטות.
8. הפעל xmipp3 - קונצנזוס עמוק ^לבחור22. כאשר קואורדינטות קלט כוללות את הפלט של sphire - בחירת קריולו (שלב 4.7) ו- xmipp3 - בחירה אוטומטית (שלב 4.6), הגדר את סוג הדגם הנבחר כ'מאומן מראש' ולדלג על אימון וציון ישירות עם דגם מאומן מראש? ל"כן" (איור 9 משלים). תריץ את זה.
9. לחץ על ניתוח תוצאות , בחלון החדש, על סמל העין לצד בחר חלקיקים / קואורדינטות עם ערכים גבוהים 'zScoreDeepLearning1'. חלון חדש ייפתח עם רשימה של כל החלקיקים (איור 4). ערכי zScore בעמודה נותנים תובנה לגבי איכות החלקיק, ערכים נמוכים פירושם איכות גרועה.
   1. לחץ על התווית_xmipp_zScoreDeepLearning כדי להזמין את החלקיקים מהגבוה ביותר לנמוך ביותר zScore. בחר את החלקיקים עם zScore גבוה מ- 0.75 ולחץ על קואורדינטות כדי ליצור את קבוצת המשנה החדשה. פעולה זו אמורה ליצור קבוצת משנה עם כ- 50000 קואורדינטות.
10. פתוח xmipp3 - מנקה מיקרוגרף עמוק. בחר כמתאם קלט את קבוצת המשנה שהושגה בשלב הקודם, מקור מיקרוגרפים זהה לקואורדינטות, ושמור על סף ב- 0.75. תריץ את זה. בדוק בכרטיסיה סיכום שמספר הקואורדינטות צומצם, אם כי במקרה זה, רק קואורדינטות מעטות מוסרות.
    הערה: שלב זה הוא מסוגל גם לנקות את ערכת הקואורדינטות והוא יכול להיות מאוד שימושי בניקוי ערכות נתונים אחרות עם יותר חפצים סרט כמו אזורי פחמן או זיהומים גדולים.
11. הפעל xmipp3 - לחלץ חלקיקים (איור 10 משלים). ציין כקלט מתאם את הקואורדינטות שהושגו לאחר השלב הקודם, מקור Micrographs כאחר, מיקרוגרפים קלט כפלט של שלב 2, הערכת CTF כפלט של הערכת xmipp3 - ctf, גורם דגימת הפחתה ל - 3, וגודל תיבת חלקיקים ל - 100. בכרטיסיה קדם-מעבדים של הטופס בחר כן לכולם. תריץ את זה.
12. בדוק כי הפלט צריך להכיל את החלקיקים בגודל מופחת של 100x100 פיקסלים וגודל פיקסלים של 4.02Å / px.
13. הפעל שוב xmipp3 - לחלץ חלקיקים לשנות את הפרמטרים הבאים: גורם דגימת הפחתה ל 1, וגודל תיבת חלקיקים ל 300. בדוק כי הפלט הוא אותה קבוצה של חלקיקים אבל עכשיו ברזולוציה המלאה.

5. סיווג 2D: קיבוץ חלקיקים דומים יחד

1. פתח את השיטה cryosparc2 - סיווג דו-יומי11 עם חלקיקי קלט כמו אלה שהושגו בשלב 4.11, בכרטיסיה סיווג דו-פעמי, מספר המחלקות ל- 128, שמור את כל הפרמטרים האחרים עם ערכי ברירת המחדל. תריץ את זה.
2. לחץ על ניתוח תוצאות ולאחר מכן על סמל העין לצד הצג מחלקות חלקיקים עם Scipion (איור 5). סיווג זה יעזור לנקות את קבוצה של חלקיקים, כמו כמה שיעורים ייראו רועש או עם חפצים. בחר את המחלקות המכילות תצוגות טובות. לחץ על חלקיקים (לחצן אדום בחלק התחתון של החלון) כדי ליצור את קבוצת המשנה המנקה יותר.
3. כעת, פתח את xmipp3 - cl2d23 והגדר כתמונות קלט את התמונות שהושגו בשלב הקודם ומספר המחלקות כ- 128. לחץ על ביצוע.
   הערה: סיווג שני זה משמש כשלב ניקוי נוסף של ערכת החלקיקים. בדרך כלל שימושי כדי להסיר כמה שיותר חלקיקים רועשים ככל האפשר. עם זאת, אם רצויה זרימת עבודה פשוטה יותר, ניתן להשתמש בשיטת סיווג 2D אחת בלבד.
4. כאשר פעולת השירות מסתיימת, בדוק את 128 הכיתות שנוצרו על-ידי לחיצה על ניתוח תוצאות ועל מה להציג: שיעורים. רוב המחלקות שנוצרו מציגות הקרנה של המאקרומולקול עם רמת פירוט מסוימת. עם זאת, חלקם נראים רועשים (בדוגמה זו כ -10 שיעורים). בחר את כל השיעורים הטובים ולחץ על לחצן שיעורים כדי ליצור קבוצת משנה חדשה עם אלה הטובים בלבד. קבוצת משנה זו תשמש כקלט לאחת מהשיטות ליצירת אמצעי אחסון התחלתי. עם אותן מחלקות נבחרות לחץ על חלקיקים כדי ליצור קבוצת משנה נקייה יותר לאחר הסרת אלה השייכים למחלקות הרעות.
5. פתח pwem - קבוצת משנה עם קבוצה מלאה של פריטים כפלט של 4.13 (כל החלקיקים בגודל המלא), הפוך קבוצת משנה אקראית ללא, ערכה אחרת כתת-קבוצה של חלקיקים שנוצרו בשלב הקודם, וקבע פעולה כהצטלבות. פעולה זו תפיק את קבוצת המשנה הקודמת מהחלקיקים ברזולוציה מלאה.

6. הערכת נפח ראשונית: בניית הניחוש הראשון של נפח 3D

1. בשלב זה, להעריך שני אמצעי אחסון ראשוניים בשיטות שונות ולאחר מכן להשתמש בכלי קונצנזוס כדי ליצור את אמצעי האחסון הסופי המשוער 3D. פתח xmipp3 - ארגן מחדש שיטת ²⁴ משמעותית עם מחלקות קלט כמו אלה שהושגו לאחר שלב 5, קבוצת סימטריה כ- c1, ושמור על הפרמטרים הנותרים עם ערכי ברירת המחדל שלהם (איור 11 משלים). בצע את זה.
2. לחץ על ניתוח תוצאות. ודאו שמתקבל נפח ברזולוציה נמוכה בגודל 100x100x100 פיקסלים וגודל פיקסלים של 4.02Å/px.
3. פתח xmipp3 - אמצעי אחסון לחיתוך/שינוי גודל (איור 12 משלים) באמצעות אמצעי אחסון קלט זה שהושג בשלב הקודם, שינוי גודל של אמצעי אחסון? כדי כן, שנה גודל לקצב דגימה וקצב דגימה של גודל ל- 1.34 Å/px. תריץ את זה. בדוק בכרטיסיה סיכום שאמצעי האחסון של הפלט בגודל הנכון.
4. כעת, צור את אמצעי האחסון ההתחלתי השני. Relion פתוח - מודל ראשוני 3D10, כמו חלקיקי קלט להשתמש בחלקיקים הטובים ברזולוציה מלאה (פלט של 5.5) ולהגדיר קוטר מסכת חלקיקים ל 402Å, לשמור על הפרמטרים הנותרים עם ערכי ברירת המחדל. תריץ את זה.
5. לחץ על נתח תוצאות ולאחר מכן ב'הצג עוצמת קול' עם: פרוסות. בדוק כי אמצעי אחסון ברזולוציה נמוכה אך עם הצורה העיקרית של המבנה מתקבל (איור 13 משלים).
6. כעת, פתחו ערכות pwem - הצטרף כדי לשלב את שני אמצעי האחסון ההתחלתיים שנוצרו כדי ליצור את הקלט לשיטת הקונצנזוס. רק ציין אמצעי אחסון כסוג קלט ובחר את שני אמצעי האחסון ההתחלתיים בערכת קלט. תריץ את זה. הפלט צריך להיות ערכה המכילה שני פריטים בשני אמצעי האחסון.
7. כלי הקונצנזוס הוא זה הכלול xmipp3 - קונצנזוס נחיל25. פתחו אותו. השתמש כתמונות בגודל מלא את החלקיקים הטובים ברזולוציה מלאה (פלט של 5.5), כנפחים ראשוניים של הערכה עם שני פריטים שנוצרו בשלב הקודם, וודא שקבוצת סימטריה היא c1. לחץ על ביצוע.
8. לחץ על ניתוח תוצאות. ודאו שמתקבל נפח פלט מפורט יותר (איור 6). למרות שיש יותר רעש סביב המבנה, כדי לקבל פרטים נוספים במפת המבנה יעזור לשלבי עידון הבאים כדי למנוע מינימה מקומית.
   הערה: אם UCSF ^Chimera26 זמין, השתמש בסמל האחרון בחלק העליון של החלון כדי לבצע תצוגה חזותית תלת-ממדית של אמצעי האחסון המתקבל.
9. פתח ובצע relion - 3D אוטומטי עידון10 כדי להפוך את המשימה הזוויתית 3D הראשון של החלקיקים. בחר כחלקיקי קלט את הפלט של 5.5, והגדר את קוטר מסיכת החלקיקים ל- 402Å. בכרטיסיה מפת הפניה תלת-ממדית, בחר כאמצעי אחסון קלט זה שהושג בשלב הקודם, סימטריה כ- c1 ומסנן התחלתי נמוך-מסירה ל- 30Å (איור משלים 14).
10. לחץ על ניתוח תוצאות. בחלון החדש בחר סופי כאמצעי אחסון כדי להציג ולחיצה על הצג עוצמת קול עם: פרוסות כדי לראות את אמצעי האחסון המתקבל. בדוק גם את מתאם מעטפת פורייה (FSC) על-ידי לחיצה על הצג התוויות רזולוציה בחלון התוצאות ואת הכיסוי הזוויתי בהפצה זוויתית תצוגה: התוויה 2D (איור 7). הנפח המשוחזר מכיל הרבה יותר פרטים (כנראה עם כמה אזורים מטושטשים בחלק החיצוני של המבנה), ואת FSC חוצה את הסף של 0.143 סביב 4.5Å. הכיסוי הזוויתי מכסה את כל כדור תלת-ממד.

סיווג 7.3D: גילוי מצבים קונפורמיים

1. באמצעות גישת קונצנזוס, אם ניתן לגלות מצבים קונפורמיים שונים בנתונים. תלוי פתוח - סיווג תלת-ממדי10 (איור 15 משלים). כמו חלקיקי קלט להשתמש אלה רק שהושגו ב 6.10, ולהגדיר קוטר מסכת חלקיקים ל 402Å. בכרטיסיה מפת הפניה תלת-ממדית, השתמש כאמצעי אחסון קלט זה המתקבל לאחר שלב 6.10, הגדר את סימטריה כ- c1 ואת המסנן הראשוני עם מעבר נמוך ל- 15Å. לבסוף, בכרטיסיה מיטוב, הגדר את מספר המחלקות ל- 3. תריץ את זה.
2. בדוק את התוצאות על ידי לחיצה על ניתוח תוצאות, בחר הצג סיווג ב- Scipion. שלושת הכיתות שנוצרו וכמה אמצעים מעניינים מוצגים. שתי המחלקות הראשונות צריכות לכלול מספר דומה של תמונות שהוקצו (עמודת גודל ) ולהיראות דומות מאוד, בעוד שלשלישי יש פחות תמונות ומראה מטושטש יותר. כמו כן, rlnAccuracacyRotations ו rlnAccuracacacyTranslations צריך להיות טוב יותר עבור שני השיעורים הראשונים. בחר את שתי המחלקות הטובות ביותר ולחץ על לחצן מחלקות כדי ליצור קבוצת משנה המכילה אותן.
3. חזור על שלבים 7.1 ו- 7.2 כדי ליצור קבוצה שנייה של כיתות טובות. שניהם יהיו הקלט של כלי הקונצנזוס.
4. פתח והפעל xmipp3 - מחלקות קונצנזוס תלת-ממדיות ובחר כמחלקות קלט את שתי קבוצות המשנה שנוצרו בשלבים הקודמים.
5. לחץ על ניתוח תוצאות. מספר החלקיקים ההם בין מחלקות מוצג: הערך הראשון הוא מספר החלקיקים ההם במחלקה הראשונה של תת-קבוצה 1 והמחלקה הראשונה של תת-קבוצה 2, הערך השני הוא מספר החלקיקים ההם במחלקה הראשונה של תת-קבוצה 1 והמחלקה השנייה של תת-קבוצה 2 וכו '. בדוק שהחלקיקים מוקצים באופן אקראי למחלקות אחת או שתיים, מה שאומר ששיטת הסיווג 3D אינה מסוגלת למצוא שינויים קונפורמיים. בהתחשב בתוצאה זו, כל קבוצת החלקיקים תשמש להמשך העיבוד.

8.3D עידון: עידון הקצאות זוויתיות של אוכלוסייה הומוגנית

1. שוב, ליישם גישה קונצנזוס בשלב זה. ראשית, פתח והפעל pwem - קבוצת משנה עם ערכה מלאה של פריטים כפלט של 6.9, הפוך קבוצת משנה אקראית ל-כן ומספר הרכיבים ל- 5000. עם זאת, נוצרת קבוצת משנה של תמונות עם יישור קודם כדי לאמן את השיטה המשמשת בשלב הבא.
2. פתח xmipp3 - יישור עמוק, הגדר תמונות קלט כפלט של חלקיקים טובים המתקבלים ב- 5.5, נפח כ- זה שהושג לאחר 6.10, אימון קלט מוגדר כ- זה שנוצר בשלב הקודם, רזולוציית יעד ל- 10Å, ולשמור על הפרמטרים הנותרים עם ערכי ברירת המחדל (איור משלים 16). לחץ על ביצוע.
3. לחץ על ניתוח תוצאות כדי לבדוק את ההתפלגות הזוויתית המתקבלת, כאשר אין הנחיות חסרות והכיסוי הזוויתי משתפר מעט בהשוואה ל- 6.10 (איור 8).
4. פתח ובצע xmipp3 - השווה זוויות ובחר כחלקיקי קלט 1 את הפלט של 6.9 וחלקיקי קלט 2 את הפלט של 8.2, ודא שקבוצת הסימטריה היא c1. שיטה זו מחשבת את ההסכם בין xmipp3 - יישור עמוק ו relion - 3D אוטומטי למקד.
5. לחץ על ניתוח תוצאות, רשימת החלקיקים, עם ההבדלים המתקבלים במשמרות וזוויות, מוצגת. לחץ על סמל הסרגל בחלק העליון של החלון, ייפתח חלון נוסף המאפשר ביצוע התוויות של המשתנים המחושבים. בחר _xmipp_angleDiff ולחץ על התוויה כדי לראות ייצוג של ההבדלים הזוויתיים לכל חלקיק. לעשות את אותו הדבר עם _xmipp_shiftDiff. בנתונים אלה, כמחצית מהחלקיקים ששתי השיטות מסכימות (איור 9). בחר את החלקיקים עם הבדלים זוויתיים הנמוכים מ- 10 מעלות וליצור קבוצת משנה חדשה.
6. כעת, פתח את xmipp3 - highres27 כדי לבצע עידון מקומי של הזוויות שהוקצו. ראשית, בחר כתמונות בגודל מלא את התמונות שהושגו בשלב הקודם, וכנפחים התחלתיים הפלט של 6.9, הגדר את רדיוס החלקיקים ל- 150 פיקסלים ואת קבוצת סימטריה כ- c1. בכרטיסיה הקצאה זוויתית, הגדר את יישור התמונה כ'מקומי', 'מספר איטראציות' ל- 1 ומקסימום. רזולוציית יעד כ- 5Å /px (איור 17 משלים). תריץ את זה.
7. בכרטיסיה סיכום בדוק שאמצעי האחסון של הפלט קטן מ- 300x300x300 פיקסלים וגודל פיקסלים מעט גבוה יותר.
8. לחץ על ניתוח תוצאות כדי לראות את התוצאות שהושגו. לחץ על הצג התוויות רזולוציה כדי לראות את ה- FSC, ובאמצעי האחסון של התצוגה: משוחזר כדי לראות את אמצעי האחסון המתקבל (איור 18 משלים). אמצעי אחסון ברזולוציה טובה קרוב 4-3.5Å מתקבל.
9. לחץ על הצג חלקיקי פלט, בחלון עם רשימת החלקיקים, לחץ על סמל הבר. בחלון החדש, בחר הקלד כהיסטוגרמה, עם 100 פחים, בחר _xmipp_cost תווית ולבסוף הקש על התוויה (איור 19 משלים). בדרך זו, היסטוגרמה של תווית העלות מוצגת, המכילה את המתאם של החלקיק עם כיוון ההקרנה שנבחר עבורו. במקרה זה, פונקציית צפיפות חד-מודולית מתקבלת, וזה סימן לכך שאין אוכלוסיות שונות בערכת החלקיקים. כך כולם ישמשו להמשך הזיכוך
   הערה: במקרה של ראיית פונקציית צפיפות רב-מודאלית, יש לבחור את ערכת החלקיקים השייכים למקסימום הגבוה יותר כדי להמשיך את זרימת העבודה רק איתם.
10. האם לפתוח ולבצע שוב xmipp3 - גבוהים עם המשך מהפעלה קודמת? כדי כן, הגדר כתמונות בגודל מלא אלה שהושגו לאחר 8.5, ובחר הפעלה קודמת עם הביצוע הקודם של Xmipp Highres. בכרטיסיה הקצאה זוויתית, הגדר את יישור התמונה כ' מקומי', עם איטראציה 1 ו- 2.6Å/px כרזולוציית יעד (רזולוציה מלאה).
11. כעת הפלט צריך להכיל אמצעי אחסון ברזולוציה מלאה (גודל 300x300x300 פיקסלים). לחץ על ניתוח תוצאות כדי לבדוק שוב את הנפח המתקבל ואת ה- FSC, שכעת אמור להיות נפח ברזולוציה גבוהה בסביבות 3Å (איור 10).

9. הערכה ועיבוד לאחר

1. פתח xmipp3 - מונוRes28 מקומי. שיטה זו תחשב את הרזולוציה באופן מקומי. הגדר כאמצעי אחסון קלט את זה שהושג לאחר 8.10, הגדר האם ברצונך להשתמש בחצי אמצעי אחסון? ל- כן, ולטווח רזולוציה מ- 1 עד 10Å. תריץ את זה.
2. לחצו על 'נתח תוצאות' ובחרו 'הצג היסטוגרמה של רזולוציה' והצג פרוסות צבעוניות (איור 11). הרזולוציה בחלקים השונים של אמצעי האחסון מוצגת. רוב voxels של החלק המרכזי של המבנה צריך להציג החלטות סביב 3Å, בעוד ההחלטות הגרועות ביותר מושגות בחלקים החיצוניים. כמו כן, היסטוגרמה של הרזולוציות לכל voxel מוצגת עם שיא סביב (אפילו מתחת) 3Å.
3. פתח והפעל xmipp3 - חידוד ^מקומי29 כדי להחיל חידוד. בחר כמפת קלט זו שהושגה ב- 8.10, וכמפה רזולוציה זו שהושגה בשלב הקודם עם MonoRes.
4. לחץ על ניתוח תוצאות כדי לבדוק את אמצעי האחסון שהושגו. פתח את האחרון, המתאים לאיטרציה האחרונה של האלגוריתם. מומלץ לפתוח את עוצמת הקול עם כלים אחרים, כגון UCSF ^Chimera26, כדי לראות טוב יותר את תכונות הווליום בתלת-ממד (איור 12).
5. לבסוף, פתח את כלי האימות הכלול ב- xmipp3 - אמת את תיקון ^יתר30 שיראה כיצד הרזולוציה משתנה עם מספר החלקיקים. פתח אותו וכלול כחלקיקי קלט את החלקיקים המתקבלים בשלב 8.5, הגדר את חשב את הרעש המיועד לרזולוציה? באפשרויות מתקדמות, הגדר את מספר החלקיקים ל-"500 1000 1500 2000 3000 5000 10000 15000 20000" (איור משלים 20). תריץ את זה.
6. לחץ על ניתוח תוצאות. שתי חלקות יופיעו (איור 13) עם התפתחות הרזולוציה, בקו הירוק, ככל שמספר החלקיקים המשמשים בשחזור יגדל. הקו האדום מייצג את ההחלטה שהושגה עם שחזור של רעש גאוסי מיושר. הרזולוציה משתפרת עם מספר החלקיקים והבדל גדול של השחזור מחלקיקים לעומת זה מרעש נצפה, המהווה אינדיקטור שיש חלקיקים עם מידע מבני טוב.
7. מהתוצאות הקודמות, ניתן לבצע התאמה של מודל בנפח שלאחר העיבוד, אשר יאפשר גילוי המבנים הביולוגיים של המאקרומולקול.

תוצאות

השתמשנו ערכת הנתונים של פלסמודיום falciparum 80S ריבוזום (ערך EMPIAR: 10028, ערך EMDB: 2660) כדי לבצע את הבדיקה, עם פרוטוקול Scipion שהוצג בסעיף הקודם, רזולוציה גבוהה 3D משוחזר נפח של macromolecule בדוגמה מסוימת זו הושג, החל במידע שנאסף על ידי המיקרוסקופ המורכב תמונות רועשות מאוד המכילות תחזיות 2D בכל כיוון של הדגימה.

התוצאות העיקריות שהושגו לאחר הפעלת הפרוטוקול כולו מוצגות באיור 10, איור 11 ואיור 12. איור 10 מייצג את אמצעי האחסון התת-ממדי שהושג לפני העיבוד. באיור 10a ניתן לראות FSC של 3 Å, שהוא קרוב מאוד למגבלה של Nyquist (עם נתונים בגודל פיקסל של 1.34 Å, מגבלת Nyquist היא 2.6 Å). איור 10b מציג כמה פרוסות של עוצמת הקול התלת-ממדי המשוחזרת עם רמות גבוהות של פרטים ומבנים מוגדרים היטב. באיור 11 מוצגות התוצאות לאחר ניתוח מקומי של עוצמת הקול בתלת-ממד המתקבלת. ניתן לראות כי רוב voxels במבנה להשיג רזולוציה מתחת 3 Å, בעיקר אלה הממוקמים בחלק המרכזי של המבנה. עם זאת, החלק החיצוני מראה החלטות גרועות יותר, מה עולה בקנה אחד עם הטשטוש המופיע באזורים אלה בפרוסות של איור 10b. איור 12 מציג את אותה מפה תלת-ממדית לאחר עיבוד המסוגל להדגיש את התדרים הגבוהים יותר של עוצמת הקול, לחשוף פרטים נוספים ולשפר את הייצוג, שניתן לראות במיוחד במצגת בתלת-ממד באיור 12c.

באיור 14, ^כימרה26 שימשה לייצוג תלת-ממדי של אמצעי האחסון המתקבל (איור 14a), הפוסט-מעובד (איור 14b) ומפת הרזולוציה (איור 14c), הצבועה בקוד הצבע של הרזולוציות המקומיות. זה יכול לתת עוד יותר מידע על המבנה המתקבל. כלי זה הוא מאוד שימושי כדי לקבל תובנה על איכות הנפח המתקבל, כמו פרטים קטנים מאוד בכל ההקשר 3D של המבנה ניתן לראות. כאשר הרזולוציה שהושגה מספיקה, ניתן למצוא אפילו חלקים ביוכימיים מסוימים של המבנה (למשל, אלפא-helices באיור 14d). באיור זה, יש להדגיש את הרזולוציה הגבוהה שהושגה בכל החלקים המרכזיים של המבנה התלת-ממדי, שניתן לראותם כאזורים הכחולים הכהים באיור 14ג'.

כל התוצאות הקודמות הושגו הודות לביצועים טובים של הפרוטוקול כולו, אבל זה לא יכול להיות המקרה. ישנן מספר דרכים לזהות התנהגות רעה. במקרה הכללי ביותר, זה קורה כאשר המבנה המתקבל יש רזולוציה נמוכה והוא אינו מסוגל להתפתח אחד טוב יותר. דוגמה אחת לכך מוצגת באיור 15. עוצמת קול מטושטשת (איור 15c) גורמת ל-FSC נמוך, שניתן לראות בעקומת ה-FSC (איור 15a) ובהיסטוגרמה של ההערכה המקומית (איור 15b). דוגמה זו נוצרה בשיטת עידון תלת-ממדי עם נתוני קלט שגויים, מכיוון שהיא ציפתה למאפיינים מסוימים בערכת הקלט של החלקיקים שהם אינם ממלאים. כפי שניתן לראות, תמיד חשוב מאוד לדעת כיצד השיטות השונות מצפות לקבל את הנתונים ולהכין אותם כראוי. באופן כללי, כאשר מתקבל פלט כמו זה באיור 15 , ייתכן שקיימת בעיה בזרימת העבודה של העיבוד או בנתונים הבסיסיים.

ישנם מספר נקודות ביקורת לאורך זרימת העבודה שניתן לנתח כדי לדעת אם הפרוטוקול מתפתח כראוי או לא. לדוגמה, מיד לאחר הבחירה, כמה מהשיטות שנדונו קודם לכן יכולות לדרג את החלקיקים ולתת ציון עבור כל אחד מהם. במקרה של חלקיקים רעים, שיטות אלה מאפשרות לזהות ולהסיר אותם. כמו כן, הסיווג הדו-יומי יכול להיות אינדיקטור טוב שיש קבוצה רעה של חלקיקים. איור 16 מראה דוגמה לסט כל כך גרוע. באיור 16a מוצגים שיעורים טובים המכילים כמה פרטים על המבנה, ואילו איור 16ב מציג שיעורים גרועים, רועשים או לא מרכזיים, במקרה האחרון ניתן לראות שהקטטה הייתה שגויה ונראה ששני חלקיקים מופיעים יחד. נקודת ביקורת נוספת היא הערכת הנפח הראשונית, איור 17 מציג דוגמה להערכות ראשוניות טובות (איור 17א) ורעות (איור 17b). ההערכה השגויה נוצרה באמצעות התקנה שגויה עבור פעולת השירות. יש לקחת בחשבון כי כל ההתקנות צריך להיעשות בזהירות, בחירה כראוי כל פרמטר על פי הנתונים המנותחים. במקרה של חוסר מפה עם קצת מידע מבני מינימלי, הזיכוך הבא לא יוכל להשיג שחזור טוב.

כאשר הבעיה היא רכישה גרועה, שבה הסרטים אינם משמרים מידע מבני, זה יהיה בלתי אפשרי לחלץ חלקיקים טובים מהם ולקבל עיבוד מוצלח. במקרה זה, יש לאסוף סרטים נוספים כדי לקבל שחזור תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה. אבל, אם זה לא המקרה, ישנן מספר דרכים לנהל בעיות לאורך זרימת העבודה של העיבוד. אם הקטיף אינו מספיק טוב, ישנן מספר דרכים לנסות לתקן אותו, למשל, לחזור על הקטיף, להשתמש בשיטות שונות, או לנסות לבחור באופן ידני חלקיקים נוספים כדי לעזור לשיטות ללמוד מהם. במהלך הסיווג הדו-יומי, אם רק כמה שיעורים טובים, שקול גם לחזור על תהליך הבחירה. בהערכת אמצעי האחסון הראשונית, נסה להשתמש במספר שיטות אם חלקן נתנו תוצאות לא מדויקות. כנ"ל לגבי עידון תלת-ממד. בעקבות נימוק זה, בכתב יד זה הוצגו מספר כלי קונצנזוס, אשר יכול להיות שימושי מאוד כדי למנוע בעיות ולהמשיך את העיבוד עם נתונים מדויקים. הודות לשימוש בקונצנזוס בין מספר שיטות, אנו יכולים למחוק נתונים שקשה לבחור, לסווג, ליישר וכו ', וזה כנראה אינדיקטור לנתונים גרועים. עם זאת, אם מספר שיטות מסוגלות להסכים בפלט שנוצר, סביר להניח שנתונים אלה מכילים מידע בעל ערך שבאמצעותו ניתן להמשיך בעיבוד.

אנו מעודדים את הקורא להוריד ערכות נתונים נוספות ולנסות לעבד אותן בהתאם להמלצות המוצגות בכתב יד זה וליצור זרימת עבודה דומה המשלבת חבילות עיבוד באמצעות Scipion. ניסיון לעבד ערכת נתונים היא הדרך הטובה ביותר ללמוד את העוצמה של כלי העיבוד הזמינים במצב החדיש ביותר ב- Cryo-EM, לדעת את הכללים הטובים ביותר כדי להתגבר על החסרונות האפשריים המופיעים במהלך העיבוד, ולהאיץ את הביצועים של השיטות הזמינות בכל מקרה בדיקה ספציפי.

איור 1. תוצאת יישור סרט. (א) החלון הראשי של התוצאות, עם רשימה של כל המיקרוגרפים שנוצרו ומידע נוסף: צפיפות הספקטרלי כוח, המסלול של היישור המשוער בקואורדינטות קוטביות, זהה בקואורדינטות קרטזיות, שם הקובץ של המיקרוגרף שנוצר. (ב) מסלול היישור המיוצג בקואורדינטות קרטזיות. (ג) המיקרוגרף שנוצר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2. הערכת CTF עם תוצאת Ctffind. החלון הראשי עם התוצאות כולל דמות עם PSD המשוער (בפינה) יחד עם PSD מגיע מהנתונים, וכמה params נטרול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3. אוספים חלונות ידניים עם Xmipp. (א) החלון הראשי עם רשימת המיקרוגרפים לעיבוד וכמה פרמטרים אחרים. (ב) לקטוף חלקיקים באופן ידני בתוך אזור של מיקרוגרף. (ג) ו -(ד) קטפו חלקיקים באופן אוטומטי לפיקוח כדי ליצור קבוצה של חלקיקי אימון עבור שיטת הקטיף האוטומטי של Xmipp. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4. קונצנזוס עמוק עם התוצאה Xmipp. הפרמטר zScoreDeepLearning נותן משקל לטוב של חלקיק והוא המפתח לגילוי חלקיקים רעים. (א) ערכי zScores הנמוכים ביותר משויכים לממצאים. (ב) zScores הגבוהים ביותר קשורים לחלקיקים המכילים את המאקרומולקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5. סיווג 2D עם תוצאת Cryosparc. המחלקות שנוצרו (ממוצעים של תת-קבוצות של חלקיקים המגיעים מאותו כיוון) מוצגים. כמה שיעורים טובים שנבחרו באדום (עם רמה מסוימת של פירוט) וכמה שיעורים גרועים שלא נבחרו (שיעורים רועשים ולא מרכזיים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6. נפח ראשוני תלת-ממדי עם תוצאת קונצנזוס נחיל. תצוגה של אמצעי האחסון ההתחלתי התלת-ממדי שהושג לאחר הפעלת כלי הקונצנזוס xmipp3 - קונצנזוס נחיל, תוך שימוש בהערכות הנפח הראשוניות התלת-ממדיות הקודמות של Xmipp ו- Relion. (א) אמצעי האחסון מיוצג על-ידי פרוסות. (ב) תצוגה חזותית תלת-ממדית של אמצעי האחסון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7. עידון של אמצעי אחסון התחלתי תלת-ממדי עם תוצאת Relion. (א) עקומת FSC שהושגה, חציית הסף ב 4.5Å, בערך. (ב) כיסוי זוויתי המוצג כתצוגה עליונה של כדור תלת-ממד. במקרה זה, מכיוון שאין סימטריה, החלקיקים שהוקצו צריכים לכסות את כל הספירה. (ג) אמצעי אחסון מעודן המיוצג על-ידי פרוסות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8. יישור תלת-ממד המבוסס על למידה עמוקה עם תוצאת Xmipp. התוצאות שנוצרו על-ידי xmipp3 - שיטת יישור עמוקה ליישור תלת-ממדי. (א) המשימה הזוויתית עבור כל חלקיק בצורה של מטריצת טרנספורמציה. (ב) הכיסוי הזוויתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9. תוצאת קונצנזוס יישור תלת-ממדי. (א) רשימת חלקיקים עם ההבדלים שהושגו בפרמטרים של שינוי וזוויות. (ב) התוויית ההבדלים הזוויתיים לחלקיק. (ג) התוויית הפרש המשמרת לכל חלקיק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 10. איטרציה סופית של תוצאת עידון תלת-ממדי. (א) עקומת FSC. (ב) אמצעי אחסון שהושג ברזולוציה מלאה על-ידי פרוסות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 11. ניתוח רזולוציה מקומית עם תוצאת Xmipp. תוצאות השיטה xmipp3 - מונורס מקומי. (א) חלק מה slices המייצגים הצבועים בערך הרזולוציה לכל voxel, כפי שצוין בקוד הצבע. (ב) היסטוגרמה של רזולוציה מקומית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 12. חידוד עם התוצאה Xmipp. תוצאות של xmipp3 - שיטת חידוד נבלים מקומית. (א) רשימת אמצעי אחסון שהושגו לכל איטרציה. (ב) אמצעי אחסון תלת-ממדי שהושג לאחר האיטרציה האחרונה המיוצגת על-ידי פרוסות. (ג) ייצוג תלת-ממדי של אמצעי האחסון הסופי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 13. אמת כלי תיקון יתר בתוצאת Xmipp. תוצאות xmipp3 - תיקון יתר של אימות. הקו הירוק מתאים לשחזור מנתונים, הקו האדום מרעש. (א) ההופכי של הרזולוציה בריבוע עם הלוגריתם של מספר החלקיקים. (ב) רזולוציה עם מספר החלקיקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 14. מספר ייצוגים תלת-ממדיים של אמצעי האחסון המתקבל. (א) אמצעי אחסון מעובד מראש. (ב) אמצעי אחסון לאחר עיבוד. (ג) רזולוציה מקומית, voxels כחול כהה הם אלה עם רזולוציה גבוהה יותר (2.75Å) ו voxels אדום כהה הם אלה עם רזולוציה נמוכה יותר (10.05Å). (ד) הגדל את עוצמת הקול שלאחר העיבוד שבה ניתן לראות חליל אלפא (אליפסה אדומה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 15. דוגמה לשחזור תלת-ממדי גרוע. (א) עקומת FSC עם נפילה חדה וחציית הסף ברזולוציה נמוכה. (ב) היסטוגרמה של רזולוציה מקומית. (ג) נפח תלת-ממדי לפי פרוסות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 16. דוגמה לשיעורי 2D. (א) שיעורים טובים המראים רמה מסוימת של פרטים. (ב) שיעורים רעים המכילים רעש וממצאים (החלק העליון שהושג עם Xmipp, נמוך יותר עם CryoSparc). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 17. דוגמה לנפח התחלתי תלת-ממדי עם איכויות שונות. (א) אמצעי אחסון ראשוני טוב שבו ניתן לצפות בצורת המאקרומולקול. (ב) אמצעי אחסון התחלתי שגוי שבו הצורה המתקבלת שונה לחלוטין מזו הצפויה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1. יצירת פרויקט סיפיון. חלון המוצג על-ידי Scipion שבו ניתן לבחור פרוייקט ישן או ליצור חלון חדש המעניק שם ומיקום עבור פרוייקט זה. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2. ייבוא שיטת סרטים. חלון המוצג על ידי Scipion כאשר pwem - ייבוא סרטים פתוח. כאן, יש לכלול את פרמטרי הרכישה העיקריים כדי לאפשר לסרטים להיות זמינים לעיבוד ב- Scipion. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3. שיטת יישור סרט. חלון המוצג על-ידי Scipion כאשר xmipp3 - יישור אופטי משמש. יש למלא את סרטי הקלט, את טווח המסגרות הנחשבת ליישור וכמה פרמטרים אחרים לעיבוד הסרטים. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 4. שיטת הערכת CTF עם Ctffind. הטופס ב Scipion עם כל השדות הדרושים כדי להפעיל את התוכנית Ctffind. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 5. קוסם בסיפיון. אשף שיסייע למשתמש למלא פרמטרים מסוימים בטופס. במקרה זה, על האשף להשלים את שדה הרזולוציה בשיטת grigoriefflab - ctffind . נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 6. שיטת עידון CTF עם Xmipp. הצורה של xmipp3 - ctf הערכה עם כל הפרמטרים כדי לבצע עידון של CTF מוערך בעבר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 7. שיטת מיקרוגרף מעבדת מראש. הצורה של xmipp3 - מיקרוגרפים מעבדים מראש המאפשר לבצע כמה פעולות עליהם. בדוגמה זו, הסר פיקסלים פגומים ומיקרוגרפים של Downsample הם השימושיים. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 8. שיטת הבחירה עם קריולו. הטופס להפעלת שיטת האיסוף Cryolo באמצעות רשת מאומנת מראש. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 9. שיטת בחירת הקונצנזוס עם Xmipp. הצורה של xmipp3 - קונצנזוס עמוק לבחור המבוסס על למידה עמוקה כדי לחשב קונצנזוס של קואורדינטות, באמצעות רשת מאומנת מראש על פני מספר קבוצות של קואורדינטות שהושגו עם שיטות קטיף שונות. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 10. תמצית שיטת חלקיקים. קלט וקדם מעבד כרטיסיות של xmipp3 - לחלץ חלקיקים. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 11.3D שיטת נפח התחלתית עם Xmipp. הצורה של השיטה xmipp3 - לשחזר משמעותי כדי לקבל מפה 3D הראשונית. הכרטיסיות קלט וקריטריונים מוצגות. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 12. שנה גודל של פעולת שירות של אמצעי אחסון. הטופס ליצירת חיתוך או שינוי גודל של אמצעי אחסון. בדוגמה זו, שיטה זו משמשת ליצירת נפח בגודל מלא לאחר xmipp3 - שחזור משמעותי. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 13.3D נפח התחלתי עם תוצאת Relion. תצוגה של אמצעי האחסון ההתחלתי תלת-ממדי המתקבל עם שיטת הדגם ההתחלתית של Relion - 3D לפי פרוסות. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 14. עידון אמצעי האחסון ההתחלתי עם Relion. הצורה של relion השיטה - 3D אוטומטי עידון. בדוגמה זו, הוא שימש כדי למקד נפח ראשוני המוערך לאחר קונצנזוס. הכרטיסיות 'מפת קלט והפניה תלת-ממדית' מוצגות. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 15.3D שיטת סיווג. צורה של relion - סיווג 3D. הכרטיסיות קלט, מפת הפניה תלת-ממדית ומיטוב מוצגות. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 16.3D יישור המבוסס על שיטת למידה עמוקה. הטופס נפתח עבור השיטה xmipp3 - יישור עמוק. כאן יש צורך לאמן רשת עם ערכת אימונים, ואז רשת זו תנבא את המשימה הזוויתית לכל חלקיק. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 17.3D שיטת עידון. צורה של שיטת xmipp3 - highres . קלט כרטיסיות והקצאה זוויתית מוצגים. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 18. איטרציה ראשונה של תוצאת עידון תלת-ממדי. (א) עקומת FSC. (ב) אמצעי אחסון שהתקבל (בגודל קטן יותר מהרזולוציה המלאה) המיוצגת כפיוסות. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 19. איטרציה ראשונה של ניתוח מתאם עידון תלת-ממדי. חלון חדש מופיע על-ידי לחיצה על סמל הסרגל בחלק העליון של החלון עם רשימת החלקיקים. בחלון עמודות התוויית ניתן ליצור היסטוגרמה של הפרמטר המשוער הרצוי. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 20. כלי אימות תיקון יתר. צורה של xmipp3 - לאמת שיטת תיקון יתר . נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

נכון לעכשיו, cryo-EM הוא כלי מפתח לחשוף את המבנה 3D של דגימות ביולוגיות. כאשר נתונים טובים נאספים עם המיקרוסקופ, כלי העיבוד הזמינים יאפשרו לנו להשיג שחזור תלת-ממדי של המאקרומולקול הנחקר. עיבוד נתונים Cryo-EM הוא מסוגל להשיג רזולוציה כמעט אטומית, שהוא המפתח להבנת ההתנהגות התפקודית של macromolecule והוא גם חיוני בגילוי סמים.

Scipion היא תוכנה המאפשרת ליצור את כל זרימת העבודה המשלבת את חבילות עיבוד התמונה הרלוונטיות ביותר באופן אינטגרטיבי, המסייע למעקב ולשחזור של כל זרימת העבודה של עיבוד תמונה. Scipion מספק קבוצה שלמה מאוד של כלים כדי לבצע את העיבוד; עם זאת, קבלת שחזורים ברזולוציות גבוהות תלויה לחלוטין באיכות הנתונים שנרכשו ובאופן עיבוד הנתונים הללו.

כדי לקבל שחזור תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה, הדרישה הראשונה היא להשיג סרטים טובים מהמיקרוסקופ, אשר משמרים מידע מבני לרזולוציה גבוהה. אם זה לא המקרה, זרימת העבודה לא תוכל לחלץ מידע בחדות גבוהה מהנתונים. לאחר מכן, זרימת עבודה מוצלחת של עיבוד אמורה להיות מסוגלת לחלץ חלקיקים שבאמת תואמים למבנה ולמצוא את הכיוונים של חלקיקים אלה בחלל 3D. אם אחד מהשלבים בזרימת העבודה נכשל, איכות אמצעי האחסון המשוחזר תיפגע. Scipion מאפשרת להשתמש בחבילות שונות בכל אחד שלבי העיבוד, אשר מסייע למצוא את הגישה המתאימה ביותר לעיבוד הנתונים. יתר על כן, הודות לחבילות רבות זמינות, כלי קונצנזוס, המגבירים את הדיוק על ידי מציאת הסכם בתפוקות המשוערות של שיטות שונות, ניתן להשתמש. כמו כן, הוא נדון בפירוט בסעיף תוצאות מייצגות מספר כלי אימות וכיצד לזהות תוצאות מדויקות ולא מדויקות בכל שלב בזרימת העבודה, כדי לזהות בעיות פוטנציאליות וכיצד לנסות לפתור אותן. ישנם מספר נקודות ביקורת לאורך הפרוטוקול שיכולים לעזור להבין אם הפרוטוקול פועל כראוי או לא. חלק מהרלוונטיים ביותר הם: איסוף, סיווג 2D, הערכת נפח ראשונית ויישור תלת-ממדי. בדיקת הקלט, חזרה על השלב בשיטה אחרת, או באמצעות קונצנזוס, הן אפשרויות זמינות ב- Scipion שהמשתמש יכול להשתמש בהן כדי למצוא פתרונות כאשר מופיעות בעיות.

לגבי הגישות הקודמות לשילוב חבילות בתחום Cryo-EM, ^Appion31 הוא היחיד המאפשר שילוב אמיתי של חבילות תוכנה שונות. עם זאת, Appion מחוברת קשר הדוק עם ^Leginon32, מערכת לאוסף אוטומטי של תמונות ממיקרוסקופים אלקטרונים. ההבדל העיקרי עם Scipion הוא כי מודל נתונים ואחסון הם פחות מצמידים. באופן כזה, כדי ליצור פרוטוקול חדש בסיפיון, רק תסריט פייתון צריך להיות מפותח. עם זאת, ב- Appion, על המפתח לכתוב את קובץ ה- Script ולשנות את מסד הנתונים המשמש כבסיס. לסיכום, Scipion פותחה כדי לפשט את התחזוקה וההרחבה.

הצגנו בכתב יד זה זרימת עבודה מלאה לעיבוד Cryo-EM, תוך שימוש במערך הנתונים האמיתי של פלסמודיום פאלסיפארום 80S ריבוזום (ערך EMPIAR: 10028, ערך EMDB: 2660). ניתן לסכם את השלבים המכוסים ונדונים כאן כיישור סרט, הערכת CTF, קטיף חלקיקים, סיווג דו-ממדי, הערכת מפה ראשונית, סיווג תלת-ממדי, עידון תלת-ממד, הערכה ולאחר עיבוד. נעשה שימוש בחבילות שונות וכלי קונצנזוס הוחלו בכמה שלבים אלה. הנפח המשוחזר בתלת-ממד האחרון השיג רזולוציה של 3 Å, ובנפח שלאחר העיבוד ניתן להבחין בין כמה מבנים משניים, כמו אלפא-הליס, המסייע לתאר כיצד אטומים מסודרים בחלל.

זרימת העבודה המוצגת בכתב יד זה מראה כיצד ניתן להשתמש ב- Scipion כדי לשלב חבילות Cryo-EM שונות בצורה פשוטה ואינטגרטיבית כדי לפשט את העיבוד, ולהשיג תוצאה אמינה יותר בו זמנית.

בעתיד, פיתוח שיטות וחבילות חדשות ימשיך לגדול ותוכנות כמו Scipion כדי לשלב בקלות את כולם יהיה אפילו יותר חשוב עבור החוקרים. גישות קונצנזוס יהיו רלוונטיות יותר גם אז, כאשר שפע של שיטות עם בסיס שונה יהיה זמין, עוזר להשיג הערכות מדויקות יותר של כל הפרמטרים הכרוכים בתהליך השיקום Cryo-EM. מעקב ושחזור הם המפתח בתהליך המחקר וקל יותר להשיג עם Scipion הודות למסגרת משותפת לביצוע זרימות עבודה שלמות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
no material is used in this article	-	-	-